微生物檢驗手冊(中文)

1、微生物檢驗手冊微生物檢驗手冊中國食品安全中心中國食品安全中心菌落總數(shù)菌落總數(shù)1、試驗材料電子天平電子天平, 藥匙, (500定夾, 均質(zhì)機,移液槍,吸管(10), 高壓滅菌鍋, 生化培育箱(35 ), 滅菌均質(zhì)袋, 固,25,1), 一次性平板 (直徑910 cm,高度1.5 cm), 菌落計數(shù)器, 酒精,滅菌試管(18 x 170mm), 試管振蕩器。2、試劑氯化鈉氯化鈉(Sigma)3次超純水3、試劑配制方法NaCl 2.125 g3次超純水250，121 NaCl 2.125 g3次超純水250，121 15分鐘滅菌。Plate Count Agar(DIFCO) 2.35 g3次超純水

2、100Plate Count Agar(DIFCO) 2.35 g3次超純水100，121 15分鐘滅菌。(3) 0.85% NaCl (100 )NaClNaCl 0.85 g3次超純水100121 15分鐘滅菌。,攪拌均勻溶解后, 分裝到試管中9t e，全部微生物試驗中，除均質(zhì)在無菌室進展，其余的操作都要在超凈工作臺內(nèi)。4、 試驗步驟全部微生物試驗中，除均質(zhì)在無菌室進展，其余的操作都要在超凈工作臺內(nèi)。無菌操作取25g或25ml樣品，參加 225滅菌生理鹽水；均質(zhì)2分鐘。取 1樣液參加到9生理鹽水試管中。依次做10倍梯度稀釋。從適宜的梯度中1加到無菌平板中2個平板，參加0平板計數(shù)瓊脂，混勻方

3、向：冷凝后放到351培育箱中培育2448h。菌落計數(shù) 菌落總數(shù)試驗方法稱量樣品稱量樣品25g +0.85% NaCl 225-stomaching 2min取取均質(zhì)后的1溶液參加到9滅菌生理鹽水試管中，vortexing dilution從從適宜的稀釋度取1加到平板中，每個稀釋度做2個平板倒45左右PCA(plate count agar)，15-20ml/平板待平板凝固后培育：351 48h菌落計數(shù)counting菌落計數(shù) (全部菌落定量試驗都實行這種方法)韓國方法中要求每個平板中30300內(nèi)的計數(shù)參照GB/T 4789.2-2022 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定大腸菌群大腸菌群定性試

4、驗：試驗材料電子天平電子天平,錐形瓶(500), 高壓滅菌鍋,生化培育箱(35 ),均質(zhì)器,試管，移液, 1),無菌平板(直徑910 cm,高1.5 cm), 磁力攪拌器、攪拌棒，試管振蕩器，載玻片、蓋玻片，酒精試劑NaClNaClBrilliant Green Lactose Broth (DIFCO)EMB Agar (DIFCO)養(yǎng)分瓊脂 (DIFCO)3次超純水(MERCK)試劑配制方法NaCl 2.125 g3次超純水250，121NaCl 2.125 g3次超純水250，121 15分鐘滅菌。Brilliant Green Lactose Broth4g到100ml3Brillia

5、nt Green Lactose Broth4g到100ml31/管15分鐘滅菌。EMB Agar (DIFCO) (100 )EMBEMB Agar 3.6g3次超純水100ml/，121 15分鐘滅菌，冷卻至45倒平板，15-20Nutrient Agar (DIFCO)2.3 g3次超純水100Nutrient Agar (DIFCO)2.3 g3次超純水100倒平板，15-20ml/皿 。，121 15分鐘滅菌，冷卻至45試驗步驟無菌操作取25 g樣品，參加225ml 滅菌生理鹽水,均質(zhì) 2分鐘。取1ml 樣液加到 10ml BGLB (2 管，帶小導(dǎo)管) 中。1110BGLB把試管放

6、到351 中培育 2448h；取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的試管在 EMB 平板上劃線。把EMB351 242h。挑取有金屬光澤的菌落劃線到養(yǎng)分瓊脂上, 351 培育 24h。將菌落革蘭氏染色并鏡檢；用API 20E 做生化鑒定。無菌操作取 25 g無菌操作取 25 g樣品，參加225ml 滅菌生理鹽水,均質(zhì) 2分鐘取取1ml 樣液加到 10ml BGLB (2 管，帶小導(dǎo)管) 中 取取產(chǎn)氣的試管在 EMB 平板上劃線 確確認(rèn)是否有金屬光澤、粘稠的綠色菌落大腸菌群在EMB上特征挑取可疑菌落挑取可疑菌落劃線到養(yǎng)分瓊脂上 ,h將將菌落革蘭氏染色并鏡檢；用API 20E 做生化鑒定定量試驗 3M 方法測大腸菌群總數(shù)取

7、樣品取樣品25g + 0.85% NaCl 225ml均質(zhì)2分鐘取1ml取1ml 樣液加到9ml 0.85% NaCl 梯度稀釋選適宜的梯度取選適宜的梯度取1ml樣液加到 3Mpetrifilmcoliformcountplate做2351,培育244小時菌落計數(shù)菌落計數(shù)蠟樣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌 s )分析方法API 50CHBAPI 50CHB Kit (社磷酸緩沖液)MYP(Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin) agar (Difco 社)50 % Egg Yolk (Difco 社) PolymyxinBSulfate(Sigma 社)Nutrient agar (D

8、ifco 社)培育基配制方法磷酸緩沖液 (800配制)33次蒸餾水到 800滅菌后 滅菌的磷酸緩沖液 1稀釋.滅菌磷酸緩沖液KH PO34g里添加3次蒸餾水 50024溶解后 添加1N NaOH 175調(diào)整 pH 到7.23 次蒸餾水到 1000后滅菌.Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin agar (1L 配制)BeefBeef ExtractPeptone Mannitol SodiumChloridePhenol Red Agar3次 蒸餾水1g10g10g10g0.025g (1015g900conc2.5mg/ 混合搖勻后滅菌.滅菌后的 MYP agar 45, P

9、olymyxin B 100,000 unit (25,000unit/stock 4固后使用) 50% 軟黃液 50ml 混合搖勻,滅菌 Petri-Dish 分注,凝PolymyxinBstock配制方法(200配制)PolymyxinPolymyxin B Sulfate (Sigma, 5,000,000 unit霉菌蒸餾水 200里溶解 調(diào)25,000unit/的 濃度 0.45filter 來過濾冷藏保管.試驗法- 定性分析法樣品 樣品 25g + 滅菌的磷酸緩沖溶液 225ml 混合stomaching 2 分鐘均質(zhì)后的樣品取 均質(zhì)后的樣品取 1 針MYP agar 里 stre

10、aking30, 24 小時培育帶渾濁的環(huán)的粉紅色菌落帶渾濁的環(huán)的粉紅色菌落(Mannitol分解)選擇不確定的狀況 24 小時 再培育后觀看取取1針 Nutrient agar 里 streaking30, 24 小時培育GramGramstaining 結(jié)果陽性, 桿菌, 孢子形成的話API 50 CHB kitVITEK 來觀看定量分析法樣品 樣品 25g + 滅菌 磷酸緩沖稀釋溶液 225ml 混合stomaching 2 分鐘滅菌的 滅菌的 9滅菌磷酸緩沖稀釋溶液試劑混合液 各 1 均質(zhì)后的樣品各 均質(zhì)后的樣品各 0.2ml 提取MYP agar 5 spreading30, 24 小時培育colony colony選擇 (帶渾濁環(huán)的粉紅色菌落) counting不確定的 不確定的 colony 中 5個 以上 取一針