生物化學RNA的生物合成市公開課獲獎課件

1、第十二章 RNA生物合成第1頁第1頁第一節(jié) RNA聚合酶及RNA轉(zhuǎn)錄普通特點轉(zhuǎn)錄體系組分模板DNA（只基因中一條鏈轉(zhuǎn)錄）底物ATP、GTP、CTP、UTP酶RNA聚合酶催化3，5-磷酸二酯鍵生成（RNA聚合酶不需引物、無較讀功效）金屬離子Mg2+、Mn2+轉(zhuǎn)錄因子（真核）參與轉(zhuǎn)錄啟動終止蛋白（因子（原核）參與轉(zhuǎn)錄終止第2頁第2頁RNA聚合酶真核生物RNA聚合酶種類及性質(zhì)種類型型型線粒體型（Mt型）分子量5.510561056105（6.46.8）105分布核仁核質(zhì)核質(zhì)線粒體產(chǎn)物 rRNA前體（5.8S、18S、28S）mRNA前體tRNA前體5s rRNA snRNA線粒體RNA對利福平敏感性

2、不敏感不敏感不敏感敏感對鵝膏蕈堿敏感性（二環(huán)八肽）不敏感非常敏感敏感不敏感第3頁第3頁第4頁第4頁原核生物RNA聚合酶E.coliRNA聚合酶是由四種亞基構(gòu)成六聚體（2）第5頁第5頁原核生物RNA聚合酶各亞基功效亞基分子量功效36512控制轉(zhuǎn)錄速率150618含有起始和催化作用155613兼有解鏈和催化作用（常見為70）70263辨認起始點，幫助關(guān)鍵酶與模板結(jié)合。（一旦轉(zhuǎn)錄開始，便與關(guān)鍵酶脫離）不清楚第6頁第6頁模板鏈（反義鏈）編碼鏈（有義鏈）轉(zhuǎn)錄模板連與編碼鏈第7頁第7頁轉(zhuǎn)錄是不對稱性對于一個基因只有模板鏈轉(zhuǎn)錄；對于不同基因模板鏈并非總在同一DNA鏈上。RNA鏈延長方向是53第8頁第8頁二、

3、轉(zhuǎn)錄與復制異同點轉(zhuǎn)錄復制模板DNA（兩條鏈均做模板）DNA（只有基因中模板鏈被轉(zhuǎn)錄），即轉(zhuǎn)錄不對稱底物ATP、GTP、CTP、UTPdATP、dGTP、dCTP、dTTP聚合酶RNA聚合酶（催化3，5-磷酸二酯鍵生成，能將兩個單核苷酸聚合，且無較讀功效）DNA聚合酶（催化3，5-磷酸二酯鍵生成，不能將兩個單核苷酸聚合，且有較讀功效）引物不需要需RNA引物堿基配對A-T、G-C、T-A、C-GA-U、G-C、T-A、C-G鏈延伸方向5353加工需要不需要第9頁第9頁第二節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄過程啟動子（promoter）：位于結(jié)構(gòu)基因上游，供RNA聚合酶及一些轉(zhuǎn)錄因子辨認結(jié)合，并啟動轉(zhuǎn)錄一段特異DNA

4、序列。類啟動子(RNA聚合酶)；類啟動子(RNA聚合酶)； 類啟動子(RNA聚合酶)-30第10頁第10頁轉(zhuǎn)錄因子（TF）：直接或間接與RNA聚合酶及模板DNA互相作用蛋白因子。參與轉(zhuǎn)錄啟動。TF(RNA聚合酶)；TF(RNA聚合酶)； TF (RNA聚合酶)RNA-pol所需基本轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子亞基構(gòu)成和分子量（kD）功 能TFA12，19，35幫助TFD與TBP對啟動子結(jié)合TFB33增進RNA-pol結(jié)合及作為其它因子橋梁TFDTATA盒結(jié)合蛋白（TBP） 38辨認與結(jié)合TATA盒TBP輔助因子（TAF）輔助TBP與DNA結(jié)合TFE57（） 34（）增進TFH 對TFRNA聚合酶最大亞基羧

5、基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）磷酸化TFF30,74與TFB結(jié)合TFH具解旋酶活性，蛋白激酶活性，使RNA-pol大亞基羧基末端結(jié)構(gòu)域磷酸化第11頁第11頁一、mRNA合成（一）起始階段1. 啟動子(類)第12頁第12頁（一）轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄前起始復合物形成在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，RNA聚合酶啟動子結(jié)合并解鏈形成轉(zhuǎn)錄泡，并產(chǎn)生第一個3，5-磷酸二酯鍵。RNA鏈第一個核苷酸多為嘌呤核苷酸，最常見為鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)錄泡RNA聚合酶RNA（鏈）編碼鏈模板鏈第13頁第13頁轉(zhuǎn)錄前起始復合物形成組裝順序為TFDABFRNA Pol E H第14頁第14頁（二）轉(zhuǎn)錄延長階段轉(zhuǎn)錄延長階段RNA聚合酶沿DNA模板

6、不斷移動，DNA不斷解鏈，RNA鏈不斷延長，轉(zhuǎn)錄后DNA單鏈不斷重新形成雙鏈第15頁第15頁第16頁第16頁（三）轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止剪切信號序列第17頁第17頁（二） rRNA合成1.rRNA基因結(jié)構(gòu)特點第18頁第18頁2.rRNA轉(zhuǎn)錄起始第19頁第19頁三、 5SrRNA和tRNA合成1.tRNA基因結(jié)構(gòu)特點及轉(zhuǎn)錄起始第20頁第20頁2. tRNA轉(zhuǎn)錄起始第21頁第21頁5SrRNA 轉(zhuǎn)錄起始第22頁第22頁第三節(jié) 真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：轉(zhuǎn)錄生成尚不含有生物活性RNA分子轉(zhuǎn)錄后加工：初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過一系列改變后含有生物活性過程加工過程包括：核苷酸部分水解、連接反應、

7、加帽、加尾以及核苷酸修飾等第23頁第23頁一、mRNA加工真核成熟mRNA前體稱為不均一核RNA（hnRNA）（一）切除內(nèi)含子，連接外顯子。發(fā)生在細胞核里。雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖第24頁第24頁外顯子（exon）：hnRNA分子中編碼氨基酸序列內(nèi)含子（intron）：hnRNA分子中不編碼氨基酸序列大多數(shù)內(nèi)含子5為GU，3為AG。剪接體（酶）催化內(nèi)含子切除和外顯子連接催化機理是親電轉(zhuǎn)酯反應內(nèi)含子功效：有些內(nèi)含子在基因表示中起作用；有些內(nèi)含子可為酶編碼第25頁第25頁第26頁第26頁（二）hnRNA5端加“帽”（三）hnRNA3加“尾”發(fā)生在細胞核里。第27頁第27頁（四）hn

8、RNA甲基化修飾發(fā)生在核內(nèi)或胞質(zhì)內(nèi)第28頁第28頁（五）RNA編輯：指改變mRNA分子中堿基而使同一基因表示出不同蛋白質(zhì)。如堿基插入、缺失、置換、錯義突變或提前產(chǎn)生終止密碼子（編輯酶）第29頁第29頁第30頁第30頁二、rRNA加工第31頁第31頁三、tRNA加工切除多出序列（內(nèi)切酶）并連接（連接酶）個別堿基甲基化（tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶）核苷內(nèi)轉(zhuǎn)位反應（假尿苷生成）脫氨反應（A轉(zhuǎn)變?yōu)镮）還原反應（雙氫尿嘧啶生成）第32頁第32頁第四節(jié) 原核生物RNA合成第33頁第33頁原核生物啟動子序列研究辦法：RNA-pol保護法分離基因加入提純RNA-pol加入核酸外切酶保護區(qū)堿基序列構(gòu)成份析第34頁第34

9、頁第35頁第35頁-35區(qū)是RNA-pol對轉(zhuǎn)錄起始辨認位點-10區(qū)主要供RNA-pol結(jié)合。第36頁第36頁一、原核生物RNA合成起始轉(zhuǎn)錄起始是指RNA-pol辨認、結(jié)合啟動子,并前移形成第一個3，5-磷酸二酯鍵過程轉(zhuǎn)錄起始復合物第37頁第37頁二、原核生物RNA合成延長階段因子與關(guān)鍵酶脫離，關(guān)鍵酶沿模板鏈向前移動RNA鏈不斷延長。第38頁第38頁三、原核生物RNA合成終止階段轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶在DNA模板上停止下來，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復合物上脫落下來。轉(zhuǎn)錄終止兩種機制：非依賴因子轉(zhuǎn)錄終止依賴因子轉(zhuǎn)錄終止第39頁第39頁1. 因子依賴性轉(zhuǎn)錄終止因子功效：能與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA結(jié)合;含有AT

10、P酶和解螺旋酶活性第40頁第40頁2. 因子不依賴性轉(zhuǎn)錄終止RNA分子中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止；使轉(zhuǎn)錄復合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。第41頁第41頁第42頁第42頁四、原核生物RNA加工（一）原核mRNA不需加工原核生物mRNA合成與翻譯同時進行原核生物翻譯不需加工修飾第43頁第43頁（二）原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工第44頁第44頁（三）原核tRNA加工切除多出序列（內(nèi)切酶）并連接（連接酶）個別堿基甲基化（tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶）核苷內(nèi)轉(zhuǎn)位反應（假尿苷生成）脫氨反應（A轉(zhuǎn)變?yōu)镮）還原反應（雙氫尿嘧啶生成）第45頁第45頁第五節(jié) RNA復制RNA復制：以進入宿主細胞病毒RNA為模

11、板，在RNA復制酶催化下合成病毒RNA過程。（一） RNA復制酶. RNA復制酶發(fā)覺 1963年在噬菌體Q（RNA噬菌體）中發(fā)覺RNA復制酶。該酶只辨認病毒本身RNA，而對宿主及其它病毒RNA無作用。第46頁第46頁.噬菌體QRNA-單鏈RNA4.5KbA2蛋白基因外殼蛋白基因復制酶亞基基因A1蛋白基因第47頁第47頁3.Q復制酶：亞基亞基亞基亞基由噬菌體Q編碼，分子量65KD，有催化作用，35個核苷酸/秒核糖體蛋白S1，分子量65KD。與噬菌體QRNA結(jié)合延長因子EF-Tu,分子量45KD，辨認模板并選擇結(jié)合底物NTP延長因子EF-Ts,分子量35KD，穩(wěn)定亞基和亞基結(jié)構(gòu)。來自宿主細胞第48

12、頁第48頁(二)RNA復制過程1.單鏈正鏈RNA復制2.單鏈負鏈RNA復制3.雙鏈RNA復制第49頁第49頁1.單鏈正鏈RNA復制（噬菌體Q 、脊髓灰質(zhì)炎病毒、SARS病毒）第50頁第50頁轉(zhuǎn)錄與復制區(qū)別項目轉(zhuǎn)錄復制模板DNA（模板鏈轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄不對稱）DNA（雙鏈同時復制）底物四種核糖核苷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）四種脫氧核糖核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）酶RNA聚合酶（無校讀功效）DNA聚合酶（大多有校讀功效）引物不需要需要RNA引物堿基配對A-UA - T產(chǎn)物單鏈RNA雙鏈DNA問題：你能總結(jié)出轉(zhuǎn)錄與復制區(qū)別嗎？第51頁第51頁歷史故事一.斷裂基因發(fā)覺1977年

13、，在寒春港會議上，來自寒春港試驗室羅伯茨（Richarl J.Roberts）和麻省理工學院癌癥研究中心夏普（Pilip A. sharp）報道了他們關(guān)于真核生物斷裂基因發(fā)覺。由于這一發(fā)覺，他們分享了1993年諾貝爾生理醫(yī)學獎第52頁第52頁英國科學家，因發(fā)覺斷裂基因于1993年獲諾貝爾獎羅伯茨（Richarl J.Roberts） 1943年出生于英格蘭得拜。1968年取得謝菲爾大學哲學博士學位。（生物化學專業(yè)），其后，他到美國哈佛大學做博士后。他曾在桑格試驗室做過短期訪問。學習RNA指紋技術(shù)和測序技術(shù)。1972-1992年，他在寒春港試驗室工作。他對腺病毒Ad2進行了精細研究。羅伯茨與其同

14、事在試驗室里分離和鑒定了許多限制酶。并用這些酶作Ad2 DNA限制酶圖譜。1974年，他們對這些片段進行測序。其中有一個小片段包括Ad2 mRNA末端和一個啟動子。正是對這個包括啟動子片段搜索，造成對RNA剪切及斷裂基因發(fā)覺。能夠說，斷裂基因發(fā)覺是羅伯茨測序研究意外發(fā)覺第53頁第53頁美國科學家，因發(fā)覺mRNA剪接于1993年獲諾貝爾獎夏普于（Pilip A. sharp） 1944年出生在美國肯塔基州。60年代，他取得肯塔基聯(lián)合學院文學士學位（化學與數(shù)學專業(yè)）。而后取得伊利諾伊大學博士學位。他先后在加州理工學院戴維森和寒春港試驗室watson(沃森)手下做過博士后。1974年，他來到麻省理工

15、學院癌癥研究中心。他集中于腫瘤病毒分子生物學和RNA剪接研究。夏暜關(guān)注腺病毒基因表示過程。他想看看hnRNA和 mRNA有什么不同。他利用DNA和RNA雜交方法找到了二者不同。他們發(fā)覺hnRNA顯著長于mRNA. mRNA不能與DNA全部雜交。在電子顯微鏡下發(fā)覺有三個環(huán)。這表明mRNA比DNA小了許多；一個連續(xù)DNA分子包含了沒有反應在mRNA中信息。夏普認為hnRNA中內(nèi)含子片斷被切除，而外顯子片斷拼接起來。 斷裂基因發(fā)覺揭示了真核生物不同于原核生物。其次，這一過程表示了生物進化中自然選擇機制美妙。第三，它成為生物研究一個主要生長點。為此。他們?nèi)〉昧?993年諾貝爾獎。第54頁第54頁霍利1922年出生于美國伊利諾斯州。1942年，他以優(yōu)秀成績畢業(yè)于伊利諾斯大學。1947年在康內(nèi)爾大學獲有機化學博士學位?；衾谘芯縯RNA之前，就已經(jīng)取得了不少優(yōu)秀結(jié)果。比如分離青霉素結(jié)晶。首先合成芐基青霉素，分析了植物生長素吲哚乙酸。初次合成組氨酰肽等等。1957-1964年，霍利在美國農(nóng)業(yè)部紐約州伊太卡“植物、土壤和營養(yǎng)試驗室工作。1964年，他受聘于康內(nèi)爾大學生物化學和分子生物學教授。從1957年起，他研究方向便集中精力在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸分析及其合成方面。因為tRNA是核酸中分子最小、結(jié)構(gòu)最簡樸一個，因此他首先選擇這種核糖核