1樣本準(zhǔn)備注意事項

1、1. 樣和預(yù)處DHPLC DNA 同源雙鏈和雜合雙鏈從色譜柱上的洗脫PCRDHPLC 色譜圖峰型相DNA分子（DNA分子一條單鏈含突變DHPLC純化的1. 樣和預(yù)處DHPLC DNA 同源雙鏈和雜合雙鏈從色譜柱上的洗脫PCRDHPLC 色譜圖峰型相DNA分子（DNA分子一條單鏈含突變DHPLC純化的PCR 樣品的處理：PCR955min1的45以下，以充分形成雜合雙鏈。2.DHPLC檢測所需要的PCR產(chǎn)物最低進(jìn)樣DHPLC是一種靈敏的突變檢測技術(shù)，對PCR 增產(chǎn)物含量增加，往往導(dǎo)致DHPLC 分辨能力的下降，或形成異常峰型，容易導(dǎo)DHPLC3mV303.PCR 產(chǎn)物的雖然DHPLC分析的DNA

2、150-800bp300bp4. PCR引物設(shè)300bpPCR 下：1 GC分布比較均勻；2 盡量使GC含量高的區(qū)域在擴增片段的兩端；3 在檢測高 GC 含量區(qū)域的突變時，有時可能需要在引物的 5端加 GC 夾。在設(shè)計引物時，最好使您感 的區(qū)域距擴增片段兩端約 30-50bp 以上。5. 陽性結(jié)果的判由于不含突變位點的PCR 產(chǎn)物（野生型PCR 產(chǎn)物）只有單一成分（即同源DNA 分子），DHPLC 圖譜上呈現(xiàn)為單一峰型（同源雙鏈峰，Homoduplex peak）。含突變成分的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)變性、退火處理后形成了異源雙鏈和同源檢測溫度下容易解鏈成單鏈 DNA 分子，與 DNASep檢測柱的

3、結(jié)合能力較雙鏈 DNA分子低，優(yōu)先被洗脫液洗脫下來，形成異源雙鏈峰（Heteroduplexpeak）PCR片段DHPLC12DHPLC 可檢出的 PCR 產(chǎn)物中突變成分最少百分含在含突變成分的PCR產(chǎn)物中，DHPLC能檢出的突變產(chǎn)物的最低量（百分含量）是評價DHPLC靈敏性的一項重要指標(biāo)。DHPLC能靈敏地識別PCR混合物中突變成分的最低含量為 5%左右。當(dāng) PCR 混合物中突變 DNA 分子達(dá)到 10%以PCR條DHPLC比如，檢測溫度、PCR引物設(shè)計、PCRDNA 聚合酶是 DHPLC 突變檢測的一個重要影響DHPLC 。DNA 異常DHPLCTaqDNA比如，檢測溫度、PCR引物設(shè)計、

4、PCRDNA 聚合酶是 DHPLC 突變檢測的一個重要影響DHPLC 。DNA 異常DHPLCTaqDNAPCR 擴增的保真性，Pfu DNA 聚合酶通常是優(yōu)先選用的品種。對于小于 250bp的片段，當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)與堿基數(shù)的乘積10000時，Taq或TaqGold 聚合酶也能獲得保真性較高的PCR 產(chǎn)物。目前國內(nèi)用戶為降低成本，常選擇普通的Taq酶，有些公司的酶效果較好，PCR反應(yīng)液含有降低柱子的分辨率和損害柱子的穩(wěn)定性的成分，應(yīng)避免成分不明的試劑（PCR穩(wěn)定劑，增強劑，添加劑等）；DNA 模板 摻入的有害雜質(zhì)；礦物油；甲酰胺；高壓滅菌水；蛋白酶 KDSOPEGtain(甲銨乙內(nèi)酯)等。檢測含

5、有上述成分的樣品時，只能采用“Ativelen洗柱子。WAVE1電接通計算機和WAVE系統(tǒng)的各。WAVE系統(tǒng)的通電順序是Chiller(樣品冷卻器ler(自動進(jìn)樣器Oven(柱箱Detector(紫外檢測器)示面板顯示“D-Line Not ready”。系統(tǒng)初始打開“Navigator operatioInitialize”鈕，等到五個設(shè)置柱箱溫按柱箱面板上的“Set/Monit”鍵，然后按上下箭頭鍵設(shè)置到所需的溫度4溶液除氣50至少 10ml 溶液，然后再接上管道，每次新?lián)Q溶液后，都要對相應(yīng)的管道進(jìn)行5高壓泵除氣 沖洗進(jìn)按自動進(jìn)樣器面板上的“WASH”鍵，沖洗進(jìn)樣器以排除氣泡23沖洗進(jìn)按自

6、動進(jìn)樣器面板上的“WASH”鍵，沖洗進(jìn)樣器以排除氣泡23次。系統(tǒng)平 按高壓泵面板上的“MANUALSET”鍵，并且設(shè)置“50%”溶液B，按 “ENTER”鍵二次使溶液 C 和溶液 D 為“0%”。將液體流速項設(shè)置 設(shè)置溫度后，按“PUMPON/OFF10 分鐘。然后依照相打開D-7000HSMAdministration界面，點擊“Applicationsetup”鈕，彈 managerDriveDirectory鈕后，關(guān)閉D-7000 HSM Administration 界面。打開 WAVEMAKER，在 WAVE 操作系統(tǒng)中，編制樣品表“S 10. 啟動樣品檢測程le Table目錄中，

7、按“Run le1. 柱子反向高步：卸下DNASep50%溶液A，50%B，0.9ml/min400psi。75將DNASep100%溶液D0.9ml/min30 min56A50%將DNASep 柱正向重新接到系統(tǒng)上。12用WAVE 100 次，沖洗柱子一次（75D3030）；10002. 3個工作日儀器不使用，需要卸下DNASep30）；10002. 3個工作日儀器不使用，需要卸下DNASep。100%溶液D0.9ml/min15min。卸下DNASep 柱。3. 系統(tǒng)的異丙醇沖WAVE3異丙醇沖洗液：50% 的異丙醇水溶液，異丙醇和水等體積混合。0.5ml/min流速，A,B D 33%30min。5 WASH 15-20 次沖洗