高表達ΔNp73基因?qū)Υ竽c癌細胞生物學行為的影響及其機制研究

1、高表達Np73基因?qū)Υ竽c癌細胞生物學舉動的影響及其機制研究固然比年來對大腸癌治療的研究已經(jīng)獲得了很大希望，但始終不克不及改變其發(fā)病率和殞命率高的特點，對患者預(yù)后亦無顯著改進。因此，本研究探究np73基因的高表達對大腸癌細胞生物學舉動的影響，為臨床防治大腸癌提供較可靠的理論根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1實行質(zhì)料1.3臺盼蘭活細胞記數(shù)測定細胞的增殖本領(lǐng)與細胞活力胰酶消化勞績細胞含懸浮及貼壁細胞制備單細胞懸液，以冷pbs懸浮，細胞濃度為1105/l。取9滴細胞懸液移入小試管內(nèi)，加1滴0.4%臺盼蘭事情液，混勻，在3in內(nèi)用血球記數(shù)板別離記數(shù)活細胞和死細胞。1.4細胞增殖曲線tt測定取對數(shù)生恒久細胞懸液20

2、0l/孔含2103個細胞接種至96孔板，于37、5%2、飽和濕度造就箱，每組天天取3個復(fù)孔，每孔參加20ltt5g/l造就4h后棄造就液，每孔參加二甲基亞砜(ds)200l，振蕩10in溶解結(jié)晶紫。酶聯(lián)免疫檢測儀測定490n波長各孔光汲取值a490值。1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡1.6byden小室體外侵襲實行用改進的byden小室法1：用人工基質(zhì)覆蓋illiellhaber濾膜上的微孔，向小室內(nèi)參加1105/l的細胞懸液,造就12h后取出濾膜,將下室面的細胞刮下，將膜結(jié)實，結(jié)晶紫染色細胞，高倍鏡下隨機取5個視野,計數(shù)細胞,取均勻值。1.8統(tǒng)計學要領(lǐng)數(shù)據(jù)效果以s表現(xiàn),接納t查驗,spss10.

3、0統(tǒng)計學軟件舉行闡發(fā)。2效果2.1臺盼蘭拒染實行2.2tt法測定細胞生長曲線tt效果表現(xiàn)，轉(zhuǎn)染np73的lv細胞較轉(zhuǎn)染空載體pdna3的lv細胞組和空缺比較組細胞生長顯著增快，差異有統(tǒng)計學意義p0.01，見圖1。圖1tt法測定細胞生長曲線2.3基因轉(zhuǎn)染對大腸癌細胞凋亡率的影響圖2np73轉(zhuǎn)染對lv細胞凋亡的影響2.4byden小室體外侵襲實行3討論研究表白np73由于n末了轉(zhuǎn)錄活化區(qū)缺失導致轉(zhuǎn)錄活化成效完全喪失,對p53和全長型p73的轉(zhuǎn)錄活化和促凋亡活性有顯著的負調(diào)治作用2,3,np73除與大腸癌的產(chǎn)生、生長干系嚴密外，對神經(jīng)母細胞瘤也是一個預(yù)示較差預(yù)后的分子標記4。但在某些腫瘤中，如甲狀腺

4、腫瘤，np73卻有著按捺增殖的作用5,6。由于np73基因在差異的腫瘤中對細胞凋亡和血管天生的影響差異，因此本實行以np73基因在對大腸癌細胞的生長、凋亡率、體外侵襲性以及對血管調(diào)治因子的表達調(diào)治作為重要切入點舉行了研究。本實行接納臺盼蘭拒染、tt測定對轉(zhuǎn)染后細胞的體外生長環(huán)境舉行了闡發(fā)。臺盼蘭拒染、tt測定均可反響細胞的增殖環(huán)境，但作用的機制與側(cè)重點差異。臺盼蘭是一種有機染料，當細胞損傷或殞命時，可透過細胞膜與崩潰的dna結(jié)合，使其著色，而活細胞制止其進入，借此可區(qū)分活細胞和死細胞。本實行用該要領(lǐng)測定細胞的總數(shù)與存活率。tt是一種淡黃色的化合物，它到場活細胞線粒體的能量代謝。在活細胞線粒體內(nèi)

5、的琥珀酸脫氫酶可將tt復(fù)原成難溶性的紫蘭色結(jié)晶物frazan并沉淀在細胞中，而死細胞無此成效。在必然的細胞范疇內(nèi)，tt結(jié)晶物形成的量與活細胞數(shù)成正比。ds能溶解細胞中藍紫色的結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490n波優(yōu)點測定其光汲取值，可以間接反響活細胞數(shù)目。我們以為，臺盼蘭拒染實行操縱簡樸，便利快捷，但效果受報酬因素影響較多。tt法較客不雅正確，是一種較好的斷定細胞增殖的指標，而byden小室體外侵襲實行，那么為檢測大腸癌細胞轉(zhuǎn)染np73基因后的侵襲力改變提供了直接證據(jù)。本實行將3種實行要領(lǐng)的效果相結(jié)合闡發(fā)更具正確性和說服力。進一步流式細胞闡發(fā)提示np73基因轉(zhuǎn)染lv后細胞凋亡比例顯著淘汰。這一效果提示np73基因過表達可以促進大腸癌細胞的惡性增殖，其大概的機制是np73的過表達通過影響p73的反式激活而導致其啟動子活性的削弱,按捺p73誘導的凋亡2。綜上所述，np73以高表達的方法到場大腸癌的產(chǎn)生生長，按捺大腸癌細胞凋亡，上調(diào)血管天生因子vegf的表達，促進了大腸癌血管增生，加強了大腸癌細胞的侵襲性。鑒于np73基因?qū)Υ竽c癌細胞的這些影響,我們以為，對np73舉行檢測，有利于從基因程度相識大腸癌的產(chǎn)生氣