人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡的調節(jié)機制研究

1、PAGE PAGE - 6 -人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡的調節(jié)機制研究周蓓朱巧鳳陳譽丹馮莉婷劉舒凌吳燕春關鍵詞人參;蛤蚧;配伍;腎陽虛;下丘腦-垂體-腎上腺軸;下丘腦-垂體-甲狀腺軸;下丘腦-垂體-性腺軸;神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的根和根莖，性微溫，味甘、微苦，主歸脾、肺、心、腎經(jīng)，臨床常用于治療久病虛羸、驚悸失眠、陽痿宮冷等1。因其具有強心、免疫增強、抗衰老、抗腫瘤等廣泛的藥理作用，故具有極高的藥用價值2。蛤蚧為壁虎科動物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus.的干燥體，性平而味咸，主歸肺、腎經(jīng)，臨床常用于

2、治療虛喘氣促、陽痿、遺精等1。本草綱目曰：“昔人言補可去弱，人參、羊肉之屬。蛤蚧補肺氣，定喘止渴，功同人參;益陰血，助精扶羸，功同羊肉”。經(jīng)典人參蛤蚧補虛藥對配伍出自衛(wèi)生寶鑒“人參蛤蚧散”、醫(yī)級“人參蛤蚧丸”、圣濟總錄“獨圣餅”等，臨床應用歷史悠久。古今諸多醫(yī)家認為蛤蚧配伍人參使用可增強補虛壯陽之效。目前的研究多集中在人參、蛤蚧為君藥的復方治療喘息性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等肺系疾病3-5。本課題組前期研究已明確蛤蚧對腫瘤、衰老等均具有實驗免疫調節(jié)作用，并對腎陽虛動物具有改善作用6-8，但蛤蚧配伍人參后，是否能增強其補腎陽作用及相關機制尚未明確。中藥配方顆粒由于質量標準統(tǒng)一，更有

3、利于進行配伍的藥效學研究。目前中藥配方顆粒的藥理作用研究主要集中在抗炎、止痛等中醫(yī)藥優(yōu)勢領域9。本研究通過氫化可的松復制腎陽虛模型大鼠，觀察人參與蛤蚧配方顆粒配伍應用對模型大鼠的補腎陽作用，并探討其對模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）軸、下丘腦-垂體-甲狀腺（hypothalamuspituitary-thyroid，HPT）軸、下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸及免疫功能形成的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡的調節(jié)機制，為人參與蛤蚧配方顆粒的臨床配伍應用提供科學依據(jù)。1材料1.1主要儀

4、器SQP型精密電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;InfiniteM200Pro型酶標儀購自瑞士Tecan公司;i2000型全自動免疫發(fā)光分析儀購自美國Abbott公司;cobas?c311型全自動生化分析儀購自德國羅氏診斷有限公司;TGL-16型低溫離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;GeneAmpPCRSystem9700型基因擴增儀、ViiATM7型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）系統(tǒng)均購自美國ABI公司;BX43型光學顯微鏡購自奧林巴斯貿(mào)易（上海）有限公司。1.2主要藥物與試劑人參配方顆粒購自江陰天江藥業(yè)有限公司（批號20220253，每2.50g顆粒相當于

5、飲片10g）;蛤蚧配方顆粒購自深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司（批號1903001C，每2.99g顆粒相當于飲片20g）;金匱腎氣丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠（批號1803280，規(guī)格360丸）;氫化可的松注射液購自百正藥業(yè)股份有限公司（批號1908003，規(guī)格10mg2mL）;環(huán)磷酸腺苷（serumcyclicadenosinemonophosphate，cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（guanosinecyclicphosphate，cGMP）、促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropinreleasinghormone，CRH）、促腎上腺皮質激素（adrenocorticotr

6、opichormone，ACTH）、皮質醇（cortisol，CORT）、睪酮（testosterone，T）的大鼠酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號分別為LY2B9CTRRR、6P6TK8JK57、N3VIFVDNRX、3H9J32UP81、512AVRZZQT、9DVDF6-2B98）;三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、雌二醇（estradiol，E2）的放射免疫分析試劑盒均購自意大利DiaSorin公司（批號分別為2

7、02246、202213B、RE34872）;鼠源IgG、IgM試劑盒均購自德國羅氏診斷有限公司（批號分別為38451501、35257501）;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司（批號15596026）;蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號G1120）;GoldView染料購自上海賽百勝基因技術有限公司（批號HGV-）;RNA酶抑制劑、SuperScriptTM反轉錄酶購自美國Epicentre公司（批號分別為SRI6310K、RF910100）;2PCRMasterMix核酸擴增試劑購自美國Arraystar公司（批號AS-MR-006-25）。1.

8、3動物48只雄性SPF級SD大鼠，體質量（20020）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2022-0002。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會審核通過（批準號DW20220226-003）。2方法2.1分組、造模與給藥大鼠適應性喂養(yǎng)1周，根據(jù)體質量按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、金匱腎氣丸組（陽性對照）、人參組、蛤蚧組、配伍組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠每天后腿肌內(nèi)注射氫化可的松25mg/kg，連續(xù)15d進行造模，根據(jù)參考文獻10判斷造模是否成功;正常組同期肌內(nèi)注射等體積生理鹽水。造模成功后，對各組大鼠進行灌胃。金匱腎氣丸組灌胃劑量為2.33g/kg，臨

9、用時用生理鹽水配制。人參、蛤蚧按照配方顆粒量/飲片量比例、人體質量60kg換算，并參照人與大鼠體表面積折算的等效劑量比值換算11，臨用時用生理鹽水溶解，37水浴攪拌5min，配制混懸液。人參組灌胃劑量為0.53g/kg（臨床等效劑量的2倍），蛤蚧組灌胃劑量為0.21g/kg（臨床等效劑量的2倍），配伍組灌胃劑量為人參配方顆粒0.53g/kg和蛤蚧配方顆粒0.21g/kg。模型組和正常組灌胃等體積生理鹽水。所有大鼠灌胃體積均為10mL/kg，每日1次，共灌胃28d。69ECAE9E-C3DB-4533-8629-989038415B822.2大鼠體質量、肛溫測定分別于灌胃前和灌胃第7、14、21

10、、28天，采用電子天平測定大鼠體質量，采用電子體溫計測定大鼠肛溫。2.3取材與處理灌胃28d后，大鼠禁食不禁水12h，然后以水合氯醛麻醉，腹主動脈取血。血樣以3000r/min于4離心10min，取上清液于-80保存。腹主動脈取血后，在冰上將大鼠左右腎上腺、甲狀腺、左右睪丸完整剪下，生理鹽水洗凈，置于4%甲醛溶液中固定。在冰下摘取大鼠下丘腦，置于凍存管在-80保存待測。2.4大鼠血清cAMP、cGMP水平檢測采用ELISA法檢測。根據(jù)“2.1”項下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項下取材與處理。按相應試劑盒說明書方法檢測大鼠血清cAMP、cGMP水平并計算cAMP/cGMP。2.5大鼠HPA軸

11、（CRH、ACTH、CORT）、HPT軸（T3、T4）、HPG軸（T、E2）、免疫（IgG、IgM）相關指標檢測根據(jù)“2.1”項下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項下取材與處理。采用ELISA法，按相應試劑盒說明書檢測大鼠血清CRH、ACTH、CORT、T水平。采用放射免疫法，按相應試劑盒說明書檢測T3、T4、E2水平。采用免疫比濁法，按相應試劑盒說明書檢測IgG、IgM水平。根據(jù)檢測結果計算T/E2。2.6大鼠腎上腺、甲狀腺、睪丸組織病理形態(tài)學觀察根據(jù)“2.1”項下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項下取材與處理。腎上腺、甲狀腺、睪丸組織用4%甲醛溶液固定，再進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟

12、包埋、切片、乙醇梯度脫蠟、HE染色，采用光學顯微鏡觀察組織病理形態(tài)學變化并拍照。2.7大鼠下丘腦CRH、TRH、GnRHmRNA表達水平檢測采用qRT-PCR法檢測。根據(jù)“2.1”項下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項下取材與處理。取-80凍存的下丘腦（每組取3只小鼠樣本），先用Trizol提取總RNA，反轉錄成cDNA后行PCR擴增，用以檢測CRH、促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropinreleasinghormone，TRH）、促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasinghormone，GnRh）mRNA表達水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。2.8統(tǒng)計學分析采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以xs表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準=0.05。3結果3.1人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠體質量、肛溫的影響與正常組比較，模型組大鼠體質量在不同時點均顯著降低（P0.05）;灌胃第7、14、21、28天，各給藥組大鼠體質量均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠體質量在不同時點的差異均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。結果見表2。與正常組比較，模型