基因工程第四章課時(shí)

1、基因工程第四章課時(shí)第1頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二切接轉(zhuǎn)增檢基因工程內(nèi)容和步驟第2頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二基因克隆和DNA分析（第5版）第一部分 基因克隆和DNA分析的基本原理第1章 為什么說基因克隆與DNA分析非常重要第2章 基因克隆的載體質(zhì)粒和噬菌體第3章 從活細(xì)胞中純化DNA第4章 DNA純化后的利用第5章 將DNA引入活細(xì)胞第6章 大腸桿菌的克隆載體第7章 真核生物的克隆載體第8章 怎樣獲得特定基因的克隆第9章 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）第二部分 基因克隆和DNA分析在研究中的應(yīng)用第10章 基因的位置和結(jié)構(gòu)的研究第11章 基因

2、表達(dá)和功能的研究第12章 基因組研究第三部分 基因克隆和DNA分析在生物技術(shù)中的應(yīng)用第13章 克隆基因的表達(dá)第14章 基因克隆和DNA分析在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第15章 基因克隆和DNA分析在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用第16章 基因克隆和DNA分析在法醫(yī)學(xué)和考古學(xué)中的應(yīng)用第3頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第4章 DNA純化后的利用DNA操作酶DNA連接酶DNA限制性內(nèi)切酶第4頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍核酸酶（nuclease）連接酶（ligase）聚合酶（polymerase）修飾酶（modifying enzyme）拓?fù)洚悩?gòu)酶（

3、topoisomerase）其它第5頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶定義：打斷DNA鏈中連接相鄰核苷酸的磷酸二酯鍵第6頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶分類：外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶從DNA分子的末端一個(gè)一個(gè)地切除核苷酸鏈在一個(gè)DNA分子內(nèi)部打開磷酸二酯鍵第7頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（

4、單鏈或雙鏈切割）-Bal31Bal31：同時(shí)對(duì)DNA分子的雙鏈末端一個(gè)一個(gè)地切除核苷酸鏈越來越短單核苷酸第8頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-核酸外切酶核酸外切酶：可以從DNA雙鏈中一條鏈的3 末端一個(gè)一個(gè)地切除核苷酸鏈產(chǎn)物：單鏈DNA分子（不能作用于單鏈分子）第9頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-S1核酸酶S1核酸酶：催化單鏈DNA分子降解

5、成為5單核苷酸作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從此處切斷核酸分子第10頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-DNaseDNase（脫氧核糖核酸酶） ：打開DNA分子內(nèi)部任意的磷酸二酯鍵（包括單鏈和雙鏈）產(chǎn)物為單核苷酸與寡核苷酸或單核苷酸（可以用在RNA提取中去除DNA）第11頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.1 核酸酶：切開、切除或降解核酸分子的酶內(nèi)切核酸酶（單鏈或雙鏈切割）-限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶：能夠識(shí)別雙鏈D

6、NA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶基因工程中主要工具酶-一把特殊的剪刀第12頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.2 連接酶：將兩個(gè)核酸分子連接起來的酶DNA連接酶DNA連接酶（ligase）：在一條DNA鏈的3末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）的情況下，能夠催化在2條DNA鏈之間形成的磷酸二酯鍵第13頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍缺口（nick）裂口（gap）第14頁，共65頁，2022年，5月20日

7、，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶DNA聚合酶DNA聚合酶：能夠合成一條與一直模板DNA或者RNA互補(bǔ)的新DNA雙鏈要素：模版和引物第15頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶種類很多，基因工程中常用到四種（1）DNA聚合酶（大腸桿菌）DNA聚合酶：當(dāng)DNA雙鏈分子中存在一個(gè)單鏈缺口時(shí)，DNA聚合酶與單鏈區(qū)域結(jié)合，合成一條新鏈，替換并降解原來存在的那段DNA具備DNA合成和水解雙重酶活性第16頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA

8、操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶（2）Klenow片段（DNA聚合酶一部分）DNA聚合酶的合成酶活性和水解酶活性是由酶分子的不同部分控制，其中酶分子前段325個(gè)氨基酸具有水解酶活性，切掉這一部分后，剩下的部分則只具有聚合酶活性，剩下的DNA聚合酶片段稱為Klenow片段，在基因工程中可以用來補(bǔ)缺口第17頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶（3）Taq DNA聚合酶（PCR）Taq DNA聚合酶是一種來源于嗜熱菌Thermus aquaticus的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，95孵育時(shí)的半衰期大于4

9、0分鐘第18頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.3 聚合酶：復(fù)制核酸分子的酶（4）反轉(zhuǎn)錄酶（病毒，依賴于RNA的DNA聚合酶）反轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模版合成互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）第19頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.4 修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶（1）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）堿性磷酸酶：去除DNA分子5末端的磷酸基團(tuán)第20頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍第21頁，共65頁，2022年，5月20

10、日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.4 修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶（2）多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）多核苷酸激酶：在DNA分子5游離末端添加磷酸基團(tuán)（活性正好和堿性磷酸酶相反）第22頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.4 修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)的酶（3）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：在DNA分子3末端添加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸構(gòu)建人工粘性末端，不需要模板第23頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.1 DNA操作酶的范圍4.1.5 拓?fù)洚悩?gòu)酶：向共

11、價(jià)閉合環(huán)狀DNA中引入或消除雙螺旋的酶第24頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二第25頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能限制性內(nèi)切酶II在特定的核苷酸序列處切割DNADNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析DNA分子大小的估計(jì)4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶通過作圖標(biāo)出一個(gè)DNA分子上的不同限制性位點(diǎn)平末端和黏末端第26頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶準(zhǔn)確可重復(fù)第27頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)

12、23分，星期二4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶20世紀(jì)50年代宿主調(diào)控性限制第28頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第29頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二1970年H.O. Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。Werner Arber 理論預(yù)見限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片斷Hamilton O. Smith 得到第一個(gè)限制酶1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能

13、4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第30頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二目前為止，在細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了1200多種限制性內(nèi)切酶，分為三類： 其識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)相距1000-5000bp，切割位點(diǎn)不表現(xiàn)嚴(yán)格的特異性；2條鏈上的斷裂位點(diǎn)相距70-75個(gè)核苷酸； 識(shí)別序列具有特異性，且序列為旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性，切割位點(diǎn)位于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列之內(nèi)，限制性內(nèi)切酶的功能核甲基化酶的功能分開；是基因工程中常用的內(nèi)切酶； 由R、MS亞基共同組成，其中MS亞基具有位點(diǎn)識(shí)別和甲基化修飾的雙重功能；R亞基具有內(nèi)切酶活性。切割位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)的一側(cè)若干堿基對(duì)處，無序列特異性，而只與識(shí)別位點(diǎn)的距離

14、有關(guān)，從7-26bp不等。在與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合之后，修飾作用和限制作用取決于兩個(gè)亞基之間的競爭。限制性內(nèi)切酶的分類4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第31頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二I和III型酶識(shí)別序列特點(diǎn)： 一般具有內(nèi)切酶和甲基化酶的活性， 識(shí)別或切割位點(diǎn)不恒定， 不具備用來做工具酶，II型酶識(shí)別序列特點(diǎn)： 均有嚴(yán)格的識(shí)別特定核苷酸的序列， 識(shí)別的核苷酸序列一般在48個(gè)堿基對(duì) 大多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)形式4.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和功能4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第32頁，共65頁，2022年，5月

15、20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA第33頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA命名：400余種II類酶，鑒定的識(shí)別和切割位點(diǎn)有300多種，商品化100多種，DNA重組技術(shù)中常用的有20多種。其命名書寫規(guī)則：以生物體屬名的第一個(gè)大寫字母和種名的前2個(gè)小寫字母構(gòu)成酶的基本名稱；若酶在一個(gè)特殊菌株上發(fā)現(xiàn)，則將株名的第一個(gè)字母加在基本名稱之后；若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還用一個(gè)大寫字母表示

16、這些非染色體的遺傳因子；酶最后的部分為羅馬字母，表明該生物發(fā)現(xiàn)此酶的先后順序。如HindIII 表明在Heamophilus influenzae d菌株種發(fā)現(xiàn)的第3種酶； EcoRI 表明在Escherichia coli的抗藥性R質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)酶第34頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA第35頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNAII 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性

17、識(shí)別雙鏈DNA分子中4 - 8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的1800旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的識(shí)別序列第36頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.2 限制性內(nèi)切酶II在特定核苷酸序列處切割DNA回文結(jié)構(gòu) 如HindIII AAGCTT TTCGAA HapII CCGG GGCC Cfr13I GGNCC CCNGG Eco81I CCTNAGG GGANTCC Not I

18、GCGGCCGC CGCCGGCG 第37頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.3 平末端和黏末端第38頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.3 平末端和黏末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 55 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G

19、A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPPstI等產(chǎn)生的3粘性末端第39頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.3 平末端和黏末端同尾酶：有些來源不同的酶盡管其識(shí)別的序列不同，但是其切割出的DNA片段是有相同的粘性末端。第40頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.4 DNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率理論上：GATC 每44 = 256個(gè)堿基 出現(xiàn)一次GGATCC 每46 = 4096個(gè)堿基 出現(xiàn)一次實(shí)際上識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生的頻率從要小一點(diǎn)（如識(shí)別6個(gè)堿基的BamHI，BglII

20、，SalI）第41頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.4 DNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率限制性酶切位點(diǎn)通常稱不會(huì)均勻分布于DNA分子中第42頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.5 在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切如何做一個(gè)酶切反應(yīng)：（1） 2ug DNA 濃縮到125ug/ml （不高不低，純）16ul（2） 限制性內(nèi)切酶 BglII （4U/ul） 一個(gè)酶單位（U）定義為一定溫度（通常為37度）下1小時(shí)內(nèi)切割1ugDNA所需要的酶量 2ug DNA 需要2U即 4U

21、/ul X 0.5ul（3） 緩沖液（buffer） 10X第43頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶第44頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.5 在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切設(shè)計(jì)一個(gè)最普通的酶切體系總體系 20ul10buffer H 2ul切割的DNA分子 16ul限制性內(nèi)切酶 BglII (4u/ul) 0.5ulH2O 其余用H2O補(bǔ)齊體系 37 2小時(shí)第45頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.5

22、在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行限制性酶切影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：酶活定義：指在最適反應(yīng)條件下（因酶而異，包括最適反應(yīng)溫度，最適緩沖條件），經(jīng)過1小時(shí)反應(yīng)將1ugDNA完全分解所需要的酶量，稱為酶活單位；影響酶活的因素：DNA的純度：限制性內(nèi)切酶消化DNA底物的反應(yīng)效率，很大程度上取決于所使用DNA本身的純度，而DNA制劑中的某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA以及SDS等都可以抑制酶的活性。如果DNA純度不夠，可以采用擴(kuò)大反應(yīng)體系來稀釋雜質(zhì)含量；酶切消化的反應(yīng)溫度：大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37，也存在許多例外條件，如BamHI30, AccIII60，TaqI 65;在實(shí)際試驗(yàn)中,甲

23、基化和星號(hào)活性是很少的. 大多數(shù)切不開都與自己的體系或者DNA質(zhì)量有關(guān).第46頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析標(biāo)準(zhǔn)電泳不能區(qū)分大小凝膠電泳可區(qū)分大小第47頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析表3-1 瓊脂糖凝膠濃度與分辨DNA大小范圍的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度/（%） 可分辨的線性DNA大小范圍/（kb）0.3 6050.6 2010.7 100.80.9 70.51.2 60.41.5 40.

24、22.0 30.1更小的DNA片段區(qū)分可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，40%聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分1-300bp的片段實(shí)驗(yàn)室通常操作的DNA片段在0. 5-10kb左右，所以一般使用0.8-1%的瓊脂糖凝膠基因組則一般使用的的瓊脂糖凝膠第48頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析上樣緩沖液： 6上樣緩沖液 ： 0.25% 溴酚藍(lán)， 0.25% 二甲苯青 FF ， 30% 甘油。 （40%蔗糖）第49頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.

25、6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析第50頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.6 對(duì)限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析凝膠中DNA分子的可視化EB在紫外照射下能把DNA分子顯示出來Gelred，SYBR Green，Goldview等放射自顯影（檢測極微量的DNA）第51頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.7 DNA分子大小的估計(jì)第52頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.8 通過作圖標(biāo)出一個(gè)DNA分子上

26、的限制性酶切位點(diǎn)第53頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.2 切割DNA的酶-限制性內(nèi)切酶4.2.8 通過作圖標(biāo)出一個(gè)DNA分子上的限制性酶切位點(diǎn)第54頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.3 連接-將DNA連接在一起第55頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二4.3 連接-將DNA連接在一起4.3.1 DNA連接酶的作用模式第56頁，共65頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)23分，星期二5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTT