核酸電泳精品課件

1、關(guān)于核酸電泳第一張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月天然DNA的制備一般地說?？侱NA主要是指基因組DNA(genomic，c DNA)，即細(xì)胞核內(nèi)的染色體DNA分子。核DNA分子呈極不對稱的線狀結(jié)構(gòu)一條染色體為一個DNA分子。高等植物核核DNA大約含有106 bp其長度與直徑的比例極不對稱使其對機械力十分敏感。雖然目前可以成功地測定出它的一級結(jié)構(gòu)。但仍難以分離出它的完整分子。第二張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.天然DNA的來源 (1)染色體DNA (2)病毒與噬菌體 (3)質(zhì)粒DNA (4)線粒體與葉綠體第三張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.DNA的提取細(xì)胞的

2、破碎破碎的手段：物理方式：超聲波法、勻漿法、液氮破碎法: 容易導(dǎo)致DNA鏈的斷裂 . 對于細(xì)胞破碎較困難的植物材料，可以輔加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎細(xì)胞。超生波液氮第四張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月總DNA的提取方法：去除糖、脂類、蛋白等，得到的就是核酸DNARNA第五張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月總DNA的提取方法：去除多糖、脂類、蛋白等，得到的就是核酸去除多糖：CTAB、PVP、高鹽溶液等去除脂類：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶、酚氯仿等DNA第六張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒DNA的提取第七張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6

3、月破壞細(xì)胞壁 溶菌酶、強堿和十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解細(xì)胞膜 十二烷基磺酸鈉(SDS) 、Triton X-100蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出來高濃度鹽離子(KCl)使變性蛋白、多糖、細(xì)胞碎屑等沉淀出來細(xì)菌線形染色體DNA的去除強熱、堿處理時，細(xì)菌線性染色體DNA變性，當(dāng)快速降溫、加入酸中和時，已變性的細(xì)菌線性染色體DNA變性不能快速復(fù)性，與其它雜質(zhì)纏繞而沉淀出來質(zhì)粒DNA雙鏈可快速恢復(fù)原狀,重新形成超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。第八張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3.DNA的濃縮(1)乙醇(2)異丙醇(3)聚乙二醇(PEG600)第九張，PPT共三

4、十四頁，創(chuàng)作于2022年6月工作區(qū)域應(yīng)與進行普通微生物實驗的區(qū)域分離好 第十張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA的提取分離第十一張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸電泳第十二張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.應(yīng)與進行普通微生物實驗的區(qū)域分離好2.使用標(biāo)有“無RNA酶”的商品試管,吸頭,溶液和水.通常新的無菌處理過的塑料試管和吸管無RNA酶 3.雙蒸水(ddH2O)和溶液應(yīng)該用RNA酶的抑制劑DEPC(焦碳酸二乙酯)進行處理:每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在搖床上充分混勻并在37下作用數(shù)小時.然后將溶液高壓滅菌15min使DEPC失活 4

5、.分離RNA以前,將一些實驗室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤4h以滅活核酶.如有可能,將其他設(shè)備也滅菌處理 前期準(zhǔn)備:第十三張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 在Trizol試劑的保護下，勻漿組織，靜置裂解細(xì)胞釋放內(nèi)含RNA，Trizol試劑對RNA有保護作用，能抑制RNA酶的活性，并且同時有裂解細(xì)胞的作用。2.將勻漿液中加入苯酚，去除裂解液中的脂類，蛋白和DNA，離心后取出上清液，里面含有RNA，而雜志留在苯酚中。3.在上清液中加入等體積異丙酮，混勻后，靜置片刻，離心，將RNA沉淀于管底。棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，離心。去上清，將沉淀在真空干燥器中烘干。第十四張，PPT共三十

6、四頁，創(chuàng)作于2022年6月核酸電泳第十五張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis)。各種生物大分子在一定pH條件下可以解離成帶電荷的離子。在電場中會向相反的電極移動。人們采用各種材料作為支持電泳介質(zhì)創(chuàng)造出許多新方法其中以瓊脂糖和聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)的凝膠電泳最為突出。自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段第十六張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠

7、電泳的原理： 當(dāng)一種分于被放置在電場當(dāng)中時、它們就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率。它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。也就是說電場強度越大電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度也就越快。反之則較慢。電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數(shù)成反比的。由于在電泳中使用了一種無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等, 降低了對流運動故已知摩擦系數(shù)是分子的大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)因此根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異。以及所帶的凈電荷的多寡。便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核園分子混合初中的各種成分被此分離開來。第十八張，

8、PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.瓊脂糖凝膠電泳2.聚丙烯酰胺凝膠電泳3.脈沖電泳凝膠電泳第十九張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月瓊脂糖 是一種從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的線性多糖聚合物。當(dāng)瓊脂糖加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)瓊脂糖由1,3連接的吡喃型-D-半乳糖與1,4連接的3,6脫水吡喃型-L-半乳糖組成。 瓊脂糖分子呈隨機線團狀，凝結(jié)初期由于氫鍵的作用形成雙鏈分子，而后再發(fā)生雙鏈分子間的連接直至最后固化。由于鏈間的連接是靠氫鍵的作用，所以一切會破壞氫鍵形成的因素都會影響凝膠的形成。1.瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度， 把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖

9、.低熔點瓊脂糖熔點為6265，溶解后在 37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連 接等. 第二十張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠的分辨能力凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小濃度越高，孔隙越小其分辨能力也就越強：濃度降低孔隙就增大其分辨力也就隨之減弱。凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為70bp-80kb之間；而要分辨較小分子旦的DNA片段，則要用聚丙烯酰胺凝膠，其分辨能力為6-1000bp之間。第二十一張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳時DNA遷移的影響因素1. DNA分子質(zhì)量的影響2. DN

10、A構(gòu)型的影響 如：質(zhì)粒 超螺旋DNA線狀DNA開環(huán)DNA3. 膠濃度的影響4. 電場強度的影響5. EB的影響6. 電泳緩沖液的影響7. 堿基組成與電泳溫度的影響EP第二十二張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳緩沖液 1. TAE (Tris-乙酸) 2. TBE (Tris-硼酸) 3. TPE (Tris-磷酸)TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使 DNA沉淀. TBE會引起高電滲現(xiàn)象。TAE緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合 二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產(chǎn)物降解.

11、電泳電壓 一般電壓為1-10V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm以下。電泳過程最好 在低溫條件下進行。 第二十三張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)(低于100道爾頓)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析。其裝載的樣品量大，回收DNA純度高.長度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分離。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和 過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長

12、鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N-亞甲雙丙烯酰胺(甲叉雙丙烯酰胺)參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠. 注意：丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺都具有神經(jīng)毒性，能夠經(jīng)過皮膚及呼吸道進入體內(nèi)，會因多次積蓄而中毒；故操作時要極其小心，需戴手套各面罩。第二十四張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月雖然聚丙烯酰胺凝膠的灌制比瓊脂糖凝膠繁鎖，但以下幾種優(yōu)點是瓊脂糖凝膠所不具備的： 1. 分辨率極高； 2. 比瓊脂精凝膠的載樣量大； 3. 回收的DNA樣品純度極高，可用于要求非常嚴(yán)格的實驗，如轉(zhuǎn)基因動 物實驗； 4. 在聚丙烯酰胺凝膠分子的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，帶有酰胺側(cè)鏈的C-C聚合物 不帶或少帶離子側(cè)鏈基

13、因； 5. 聚丙烯酰胺凝膠無色透明。比瓊脂糖凝膠的紫外線吸收低、抗腐蝕性 強、機械強度高、韌性好。第二十五張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠.1.按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂 糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚 丙烯酰胺液漏出.2.將裝好的玻璃電泳板傾斜成4560角.3.按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù).4.加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液 體接近溢出時為止.5.立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力 的夾將梳子夾在一邊的玻璃板 上，然后將玻璃板斜靠在物體上，

14、使 成10角，可減少液體泄漏的機會.6.室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE 緩沖液.7.小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳 子上吸附的及凝膠頂部未聚合 的丙烯酰胺會流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn) 生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則.8.將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時不 要產(chǎn)生氣泡.9.接好電極，電壓為1-8V/cm，進行電泳.10.根據(jù)指示劑遷移位置來判定是否終止電泳.11.電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻 璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻 璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶 液中，15

15、30min后取出水洗紫外儀下觀察結(jié)果.12.聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng以上量的DNA條帶.要求更高 的靈敏度，可用銀染.第二十六張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月同濃度丙烯酰胺和DNA的 有效分離范圍見表丙烯酰胺(%)有效分離范圍(bp)溴酚蘭*二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數(shù)目(bp).第二十七張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA染色:a. 溴化乙錠(Ethidi

16、um bromide，EB) 在凝放電泳中，加入溴化乙錠染料對核酸分子染色之后(凝膠電泳液中加入終濃度為 0.5ug/ml的EB) 。將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察便可以十分敏感而方便地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位即使每條DNA帶中僅含有0.05ug的微量DNA也可以被清晰地段現(xiàn)出來。溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料可以插入列DNA或RNA分子的堿基之間。并在302nm波長的紫外光照射下有最大紅色熒光(590nm)發(fā)出。EB的突出缺點：為中度毒性的強誘變劑(302nm透照，254nm外照)第二十八張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳載樣緩沖液(Loading buffer):核酸

17、電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在 1%和1.4%瓊脂糖中電泳時，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似.指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用有:增加樣 品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi);在電泳中形成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置;使樣品呈色，使加樣操作更方便.第二十九張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于20

18、22年6月b.銀染色:銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色，其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收. 第三十張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月c. SYBR Green IA minor groove binding dyeInitial PhaseExponential PhasePlateau Phase第三十一張，PPT共三十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3.脈沖電泳凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE) 在電場的作用下DNA可進入較小的瓊脂糖凝膠孔中，大的分子只能進入大的膠孔，但需要較長的時間方能找到可進入的膠孔，所以泳動軌跡彎曲，速度緩慢。大于30kb和DNA分子在電泳中只能頭尾牽引進入膠孔，需定期改變電