高脂肪酶活性菌株的選育及其發(fā)酵制備豆豉中磷脂類物質(zhì)含量的變化

1、高脂肪酶活性菌株的選育及其發(fā)酵制備豆豉中磷脂類物質(zhì)含量的變化豆豉為我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，具有調(diào)節(jié)血脂、改善心血管功能、降低血糖、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等作用1-2。大豆在發(fā)酵過程中經(jīng)多種微生物酶的作用，一些成分發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，其中報(bào)道較多的如大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元、大豆蛋白轉(zhuǎn)化為小分子肽或氨基酸3-4，而磷脂類成分的變化鮮見報(bào)道。磷脂是組成人體細(xì)胞的主要成分,對(duì)肝病、高血壓、阿爾茲海默癥等疾病的防治有一定的效果5-7。大豆磷脂是植物型磷脂的主要來源，是多元醇與脂肪酸及其衍生物酯化而形成的弱極性化合物，根據(jù)堿基不同分為磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰肌醇(phos

2、phatidylinositol, PI)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)等。功能性磷脂的合成常采用脂肪酶作為催化劑實(shí)現(xiàn)富含特殊功能脂肪酸為底物的?；w與磷脂的酯交換反應(yīng)8-9。本研究首次結(jié)合常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變育種技術(shù)10-11選育高脂肪酶活性的優(yōu)良菌株，考察其發(fā)酵制備豆豉過程中PC、PI和PE功能性成分的含量變化，確定富含功能性磷脂的豆豉制備工藝，提高豆豉的應(yīng)用價(jià)值。2.2 ARTP誘變育種結(jié)果2.2.1 誘變時(shí)間的確定圖2為GD12誘變時(shí)間-致死率曲線

3、，誘變20 s后該菌的致死率迅速升高，誘變50 s時(shí)致死率達(dá)到最高為(903)%。通常情況下，當(dāng)致死率90%，菌株發(fā)生突變的概率較高且不易回突，因此，最終采用ARTP誘變處理時(shí)間為50 s。圖2 GD12 ARTP致死率曲線Fig.2 Fatality rate curve of GD12 with the ARTP treatment2.2.2 高產(chǎn)脂肪酶菌株的選育結(jié)果出發(fā)菌株經(jīng)50 s誘變處理后，將菌液涂于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到12株突變株，將出發(fā)菌株和各突變株通過脂肪酶活性的初篩和復(fù)篩，獲得4株脂肪酶活性高于出發(fā)菌株的突變株，其中GD12-11的活性最高，脂肪酶活性為(5 547305

4、)U/L，比出發(fā)菌株GD12酶活性提高了25.98%。2.2.3 豆豉發(fā)酵過程中PC、PI和PE的含量變化2.2.3.1 對(duì)照品和樣品的HPLC圖如圖3所示。相同色譜條件下，PC、PI(純度50%)和PE對(duì)照品的保留時(shí)間分別為8.7、13.0、7.5 min, 樣品在與對(duì)照品色譜峰對(duì)應(yīng)處顯示相同的色譜峰，且分離度較好。圖3 PC、PI、PE對(duì)照品及樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC diagrams of PC， PI， PE reference substances and the sample2.2.3.2 豆豉發(fā)酵過程中PC、PI和PE的含量變化圖4為GD12和GD12-11發(fā)酵制備豆

5、豉不同時(shí)間PC、PI和PE的含量變化曲線。黑豆未發(fā)酵前(0 h)PC、PI和PE的含量僅為(0.0490.012)、(0.0940.011)、(0.0310.002)mg/g，PC于發(fā)酵7 d含量達(dá)到最高，突變菌株發(fā)酵的豆豉PC含量略高于出發(fā)菌株，但差異不明顯，7 d分別達(dá)到(0.3410.018)和(0.3540.012)mg/g，隨后含量逐漸下降，發(fā)酵15 d時(shí)，含量降至接近發(fā)酵前(圖4-a)；PI也于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值，但出發(fā)菌株制備的豆豉PI含量高于突變株，含量分別為(3.2170.011)和(2.3950.015)mg/g，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長其含量逐漸下降，于發(fā)酵15 d降至接近發(fā)酵

6、前(圖4-b)；PE在第7天出發(fā)菌株發(fā)酵樣品含量達(dá)到最高為(1.3320.008)mg/g，突變菌株發(fā)酵樣品于第9天達(dá)到峰值為(1.3990.011) mg/g，高于出發(fā)株(圖4-c)。對(duì)比發(fā)酵7 d和9 d豆豉中3種磷脂的總含量，7 d為(3.9930.034)mg/g，9 d為(3.9690.021)mg/g，確定7 d為豆豉的最佳發(fā)酵時(shí)間。a-PC;b-PI;c-PE圖4 豆豉發(fā)酵過程中磷脂類成分含量的變化Fig.4 Content change of phosphlipid in Douchi during fermentation2.3 新型豆豉與市售淡豆豉3種磷脂類成分的含量對(duì)比如

7、圖5所示，GD12和GD12-11發(fā)酵7 d制備的豆豉(新型豆豉)PC含量分別為(0.3410.016)和(0.354 0.012)mg/g，約為市售淡豆豉(0.0650.008)mg/g的5倍；PI含量分別為(3.2170.032)和(2.3950.015)mg/g，約為市售淡豆豉(0.2880.011)mg/g的為811倍；PE含量分別為(1.3320.021)和(1.2440.021)mg/g，約為市售淡豆豉(0.0420.006)mg/g的30倍。新型豆豉3種磷脂類成分的含量均明顯高于市售淡豆豉飲片。圖5 新型豆豉與市售淡豆豉3種磷脂類成分的含量對(duì)比Fig.5 Contents of

8、three phospholipids between new-type Douchi and Semen Sojae Praeparatumon3 結(jié)論與討論課題組前期從6個(gè)產(chǎn)地淡豆豉中分離出14個(gè)野生型菌株，包括3株細(xì)菌和11株霉菌，其中傘枝犁頭霉為優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌15。又以傘枝犁頭霉為發(fā)酵菌株，考察了淡豆豉和豆豉純種發(fā)酵過程中17種游離氨基酸的含量變化，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，精氨酸和絲氨酸的含量下降，脯氨酸、組氨酸、谷氨酸和甘氨酸的含量升高，其余氨基酸未發(fā)生明顯變化16。本研究從淡豆豉中篩選出較高脂肪酶活性的菌株經(jīng)鑒定也是傘枝犁頭霉，可用于制備富含功能性磷脂型豆豉，傘枝梨頭霉在釀造大曲1

9、7和豆糝18中均有發(fā)現(xiàn)，該菌具有很強(qiáng)的耐熱、生長能力，能高產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶19。本研究從淡豆豉飲片中篩選高脂肪酶活性野生菌株并采用ARTP技術(shù)誘變處理，使出發(fā)菌株的脂肪酶活性提高了25.98%。出發(fā)菌和突變菌發(fā)酵制備的豆豉中3種磷脂類成分含量均明顯高于市售淡豆豉，但出發(fā)菌和突變菌之間差異不顯著，可進(jìn)一步采用復(fù)合誘變方法以顯著提高菌株的脂肪酶活性，以期更大幅度地提高磷脂類成分的含量。不同磷脂由于其組成的基團(tuán)不同而具有不同的性質(zhì)和功能，本研究制備的豆豉中PI和PE的含量明顯高于PC的含量，表明該豆鼓可能具有更好的降血脂作用。有研究證明，豆豉中富含功能性磷脂，并含有大豆異黃酮、活性肽等成分，有利于保護(hù)豆豉中功能性磷脂的穩(wěn)定性20-21。通過優(yōu)選的菌株制備豆豉，3種磷脂的含量呈先升高再下降的趨勢(shì)，可能是由于磷脂在脂肪酶或磷脂酶的作用下進(jìn)一步水解為甘油磷脂酰膽堿，后續(xù)可進(jìn)一步考察其穩(wěn)定性。另外，采用優(yōu)選菌株制備的豆豉中3種磷脂類成分的含量明顯高于市售淡豆豉，可能是由于淡豆豉發(fā)酵時(shí)間過短或過長而導(dǎo)致磷脂類成分含量較低，或市售淡豆豉發(fā)酵菌種復(fù)雜多樣，產(chǎn)生的脂肪酶活性較