游離鋅離子形態(tài)學(xué)檢測方法探究

1、游離鋅離子形態(tài)學(xué)檢測方法探究【摘要】目的:使用ivZnSAG、ZnSeAG、iZnSAG、TSQ熒光、Zinquin熒光對海馬苔蘚游離鋅離子進展染色和比擬。方法:ivZnSAG：采用Na2S溶液灌流的鋅離子結(jié)合方式；ZnSeAG：采用事先注射硒酸鈉的體內(nèi)鋅離子結(jié)合方式；iZnSAG：采用取動物新穎組織浸泡在浸染液中的鋅離子結(jié)合方式；以上三種方法處理后均采用一樣的AG孵育顯色。TSQ、Zinquin熒光:均為新穎組織取材，液氮處理后熒光下觀察。結(jié)果：在小鼠海馬，所有染色方法均能標(biāo)記出苔蘚纖維的染色，各種染色在苔蘚纖維標(biāo)記有細節(jié)上的差異。所有染色方法中特異性最高的是ZnSeAG；但其敏感性相對較差

2、。而ivZnSAG的敏感性最高，而其特異性那么相對較差。結(jié)論：本實驗中使用的游離鋅離子染色方法都能成功的對游離鋅離子進展標(biāo)記，而這些染色方法的特異性和敏感性各有不同，對染色細節(jié)的雕琢才能也各有不同，因此可以根據(jù)這些方法的各自特點在實驗選取合適的方法。bjetive:TparethedifferenedyingresultsfthefreezininthehippapusssyfiberbeteenthedifferentethdssuhasNa2SAG、ZnSeAG、iZnSAG、TSQflureseneandZinquinfluresene.ethd:Na2SAG：zinasbinedith

3、sdiusulphideperfusin;ZnSeAG：zinasbinedithinjetinsdiuseleniteinadvaned；iZnSAG：theanialsfreshtissueiersedintheTisiersinfluid.AbvedthreeethdsereflledbythesaeAGethd.TSQ、Zinquinfluresene:theanialsfreshtissueserebservedundertheflureseneirspeafterthefrzenintheliquidnitrgen.Results:Inthehippapusftheie,thess

4、yfiberuldbestainedbyallftheabvedethds.Heverthereeresedifferenesbeteentheindetails.Angallftheethdsentinedabve,theZnSeAGethdhadthestspeifiityandthelestsensibilitybuttheivZnSAGethdnthentraryprperly.nlusin:Allftheabveethdsuldaththezin,butthespeifiityandsensibilityaredifferentrespetively.Therefrethesedif

5、ferentethdsareusedinthedifferentexperientsiththedifferentdestinatin.材料與方法1.2主要試劑和藥品TSQ熒光染色試劑(Invitrgen);Zinquin熒光染色試劑(日本，Djindabratries);乳化銀(Fluka);戊巴比妥鈉(Siga);恒冷箱切片機(LEia);雙目光學(xué)顯微鏡(lypus)。1.3實驗方法1.3.1AG浸染法(iZnSAG)實驗動物2只，均用氯化鈉肝素溶液9l0.9%氯化鈉+1l肝素500IU/l灌流30s，直接用250l3%的戊二醛固定液灌流15in。所有的溶液均用0.5的索倫森磷酸鹽溶液緩沖

6、。迅速取腦組織，并將組織放在快速組織切片機上，切出12厚的切片，將切片浸入改進Ti溶液中，即浸入含0.1%硫化鈉和3%戊二醛的0.1的索倫森磷酸鹽緩沖液中，pH為7.4。將染缸置于震蕩器上，保持4。72h后，將切片用0.1的磷酸鹽緩沖液小心沖洗10in。用于光鏡的：將切片放入30%蔗糖溶液中，直至切片沉到玻璃杯底部。將切片用2冷凍后快速置于冰凍切片機上，降溫至-17，切10切片，然后切片置于AG孵育液1內(nèi)并在恒溫(26)振動水浴箱內(nèi)孵育60in，常規(guī)脫水透明后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3.2硒酸鈉注射AG法ZnSeAG)實驗動物2只，首先動物預(yù)先注射0.1%硒酸鈉30g/kg，待

7、動物奄奄一息瀕死時腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，用蠕動泵經(jīng)左心室灌注生理鹽水及2.5%戊二醛灌流，迅速取腦，然后將腦組織放入2.5%戊二醛固定液中后固定46h，然后置于30%蔗糖溶液中，直至組織塊沉到玻璃杯底部。常規(guī)10冰凍切片機切片，然后切片置于AG孵育液1內(nèi)并在恒溫(26)振動水浴箱內(nèi)孵育60in，常規(guī)脫水透明后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3.3硫化鈉灌流AG法(ivZnSAG)實驗動物2只，頸椎離斷后，首先灌注0.3硫化鈉溶液10in大約150l，然后灌注生理鹽水10in大約150l，最后灌注2.5戊二醛10in大約150l。迅速取大腦組織、2.5戊二醛后固定3h。然

8、后標(biāo)本置于30%蔗糖液4冰箱保存過夜。次日，標(biāo)本用恒冷切片機制備10的冰凍切片，切片置于AG孵育液1內(nèi)并在恒溫(26)振動水浴箱內(nèi)孵育60in，常規(guī)脫水透明后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3.4Zinquin熒光染色實驗動物2只，過量麻藥處死，迅速取腦，放入液氮中，10in后，將腦組織放入冰凍切片機中，冰凍切片20，空氣中晾干。冷丙酮固定10in，Zinquin熒光溶液150孵育2h避光，0.1PBS沖洗3次各10in避光。熒光顯微鏡觀察，360n紫外光激發(fā)。1.3.5TSQ熒光染色實驗動物2只，過量麻藥處死，迅速取出大腦，放入液氮中，10in后，將腦組織置于冰凍切片機中，冰凍切片2

9、0，空氣中晾干。避光條件下，切片浸入4.5TSQ溶液中孵育6090s，然后用0.9%生理鹽水沖洗60s。熒光顯微鏡觀察，360n紫外光激發(fā)。2結(jié)果圖1小鼠海馬三種AG反響陽性顆粒的分布403討論機體內(nèi)游離鋅離子的染色方法眾多，主要有各種AG染色方法以及各種鋅離子染色熒光。對于各種鋅離子染色的特點缺乏專門的文獻進展報道，因此使實驗方法的選擇成了一個難題。本實驗使用5種比擬常規(guī)的機體內(nèi)游離鋅離子追蹤的染色方法，對其染色特點進展了比對。在本次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)ZnSeAG染色法對游離鋅離子的特異性很高，但其染色強度稍差，因此非常適用于一些含鋅較多的區(qū)域來表達游離鋅離子染色的細節(jié)，譬如對小鼠癲癇后海馬苔

10、蘚纖維出芽FS進展染色。此前，我們曾使用此方法對匹羅卡品小鼠癲癇模型的海馬的FS進展了染色，獲得了較好的效果。ivZnSAG染色法對游離鋅離子的敏感性非常高，其染色強度是3種AG染色中最高的，但非特異性反響稍多，此種方法比擬適用于含鋅量較少的組織部位；而且由于其采用了組織灌流Na2S的鋅離子結(jié)合方式，所以對組織內(nèi)游離鋅離子的結(jié)合存在著即時性，非常合適捕捉機體某種生理狀態(tài)或病理態(tài)下鋅離子的分布狀態(tài)。iZnSAG在3種AG染色方法中特異性和敏感性居中，顯得特點缺乏，但是此種方法可以使一些神經(jīng)膠質(zhì)細胞著色，這個染色特點也答應(yīng)以做為神經(jīng)膠質(zhì)細胞染色方法方面的一個開展方向。另外，浸染法的鋅離子結(jié)合是新穎組織浸泡于浸染液中，因此其標(biāo)本中染色差異是3種AG方法中最低的，根本不受動物的個體差異影響，非常合適做鋅離子濃度在不同動物之間的比對。本實驗還采用了TSQ、Zinquin兩種熒光染色法對海馬苔蘚纖維進展了染色。兩種熒光染色均能標(biāo)記出苔蘚纖維，但其熒光染色與AG類染色方法相比，染色彌散且缺乏對細節(jié)的渲染才能。因此這兩種熒光染色法適用于對染色細節(jié)要求不高而對染色敏感性要求較高的實驗，譬如一些體外培養(yǎng)細胞的實驗。另外，兩種熒光染色可以與其他物質(zhì)進展熒光下的雙重標(biāo)記甚至三重標(biāo)記，可以檢測出體內(nèi)游離鋅離子與其他的檢測物質(zhì)之間的互相分布情況，這個優(yōu)勢是3種AG方法所不具備的。在三種AG染色法中