骨組織工程知識(shí)

1、骨組織工程骨組織工程本質(zhì)上說，就是用一個(gè)有利于細(xì)胞黏附和保持其功能的支架，在特定的骨誘導(dǎo)因子作用下，與富含骨始祖細(xì)胞共同作用。但是，到今天，能夠血管化，具有一定力學(xué)強(qiáng)度的能促進(jìn)骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)的構(gòu)造物也僅僅只是理論上的證明。對(duì)細(xì)胞功能，細(xì)胞外基質(zhì)形成的了解對(duì)我們制備有利于細(xì)胞吸附，保持細(xì)胞功能的支架是非常重要的。隨著人口老年化問題的突出，一些由疾病或者外傷引起的組織缺損極大的降低了人民的生活質(zhì)量，在臨床上，人工關(guān)節(jié)的置換在治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎以及骨質(zhì)疏松癥方面取得不錯(cuò)的效果，也極大的提高病人的生活質(zhì)量，但是由于侵蝕作用，力學(xué)性質(zhì)的改變等也會(huì)導(dǎo)致非常嚴(yán)重的后果。臨床上也期望能發(fā)展一種能促進(jìn)骨

2、組織在生的新的治療方法，即通過骨組織工程來制備一種“活的”，能與周圍正常組織相互作用的修補(bǔ)物。一般用來產(chǎn)生新組織的方法，是通過合適的三維支架在生物反應(yīng)器內(nèi)，讓從活體組織中取得細(xì)胞進(jìn)行增殖。一般生物反應(yīng)器可以通過一個(gè)半透膜來進(jìn)行氣體交換，通過旋轉(zhuǎn)來獲得微重力環(huán)境以及構(gòu)建組織生長(zhǎng)微環(huán)境。另外的一種方法就是將沒有接種上細(xì)胞的支架放到體內(nèi)，讓周圍的細(xì)胞向其擴(kuò)散生長(zhǎng)或者在植入幾天后將細(xì)胞注射到支架上，即將人體作為一種天然的生物反應(yīng)器。一般來說，對(duì)于骨組織工程來說，一般可以分為六個(gè)階段，1，制造可吸收的支架。2，在靜態(tài)的環(huán)境下，將成骨細(xì)胞或者軟骨細(xì)胞接種到支架上面。3，在動(dòng)態(tài)的環(huán)境中培養(yǎng)改組織。4，將成熟

3、的組織在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行培養(yǎng)，生物反應(yīng)器。5，進(jìn)行手術(shù)移植。6，對(duì)移植后的組織工程支架進(jìn)行觀察，是否被肌體同化或者需要重新建立。臨床需求骨折的治療一直是社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)關(guān)心的問題，在英國(guó)每年在這個(gè)方面的發(fā)費(fèi)達(dá)9億英鎊，并且隨著老年化問題的不斷突出，費(fèi)用在逐步增加。每年在英國(guó)有150，000例由于骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折。特別是股骨頭骨折具有更高的致殘率和死亡率，一般來說不到一半的病人在手術(shù)后能回家生活。30%到50%的臀部骨折患者需要再次進(jìn)行手術(shù)效正，同時(shí)有很大部分的別人需要進(jìn)行骨修補(bǔ)。由于在重建手術(shù)方面，技術(shù)和方法上的缺少，使得能夠通過骨組織工程而受益的病人數(shù)目大大增加。很顯然，在一些缺損修補(bǔ)手術(shù)中，

4、我們需要具有更好生物相容性，能與天然組織相互作用的整形外科移入物，目前使用的治療方法包括自體移植法和同種異體移植方法，他們主要使用血管化的腓骨和髂骨頂部以及其他部位的骨骼。雖然這是整形外科常用的方法，但是它們?nèi)杂性S多限制條件。自體移植，一般來自髂骨頂部，成本很高，并且受病人供體部位的健康狀態(tài)影響;異體移植容易產(chǎn)生感染或者其他的疾病。大體上，組織工程包含3個(gè)要素，1干細(xì)胞或者前體細(xì)胞，2適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)支架，3生長(zhǎng)因子。這個(gè)3個(gè)方面的任何一個(gè)方面的限制或者發(fā)展都會(huì)對(duì)組織工程產(chǎn)生一定的影響。干細(xì)胞長(zhǎng)期以來人們就認(rèn)識(shí)到骨組織具有很強(qiáng)的再生能力，因?yàn)槠鋬?nèi)部細(xì)胞具有一些干細(xì)胞的性質(zhì)。這些多功能基質(zhì)干細(xì)胞主要

5、位于骨髓中，它們能分化為纖維原細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，以及組織網(wǎng)狀細(xì)胞。并且由這些干細(xì)胞產(chǎn)生的能演變成特定細(xì)胞株的始祖細(xì)胞似乎可以在外觀上轉(zhuǎn)變。對(duì)于很多種物種來說，通過移植，在體外進(jìn)行擴(kuò)增的骨髓細(xì)胞可以治療小的骨缺損并且產(chǎn)生新的成骨組織。特別是人的骨髓成骨干細(xì)胞，可以通過特定的具有選擇性的標(biāo)記（比如STRO-1CD34來進(jìn)行分離和富集。這些細(xì)胞很容易進(jìn)行擴(kuò)增，這也暗示了它們?cè)诠撬柙偕矫娴臐撃?。由于間充質(zhì)干細(xì)胞缺少不具備免疫原性，這為這類細(xì)胞在骨修補(bǔ)方面的應(yīng)用打開了大門。雖然這種灌注間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，對(duì)病灶部位的干細(xì)胞是否會(huì)產(chǎn)生影響還不知道。盡管注射骨髓干細(xì)胞是一種簡(jiǎn)單并且安全的方法，但是

6、對(duì)于大規(guī)模的骨缺損來說，具有恰當(dāng)性質(zhì)，形狀，大小以及力學(xué)性能的支架也是必須的。支架理想的條件下，一個(gè)支架應(yīng)該具有下面的一些性質(zhì):1具有3維的多孔結(jié)構(gòu)，并且這些孔應(yīng)該是連通的，這樣有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞以及代謝廢物的排出;2具有良好的生物相容性，可以生物吸收，并且降解的速度與細(xì)胞或者組織的生長(zhǎng)速度一致;3表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)能很好的促進(jìn)細(xì)胞的黏附，增殖以及分化;4具有和替代組織類似的力學(xué)性能。這種3維的支架對(duì)于支持細(xì)胞的增殖，保持細(xì)胞功能以及細(xì)胞的分化都是必須的，并且支架的形狀也最終決定新生的軟骨或者骨組織的形狀。材料在過去的30年中，發(fā)展了很多“理想的”支架材料，但真正能用到臨床的卻很少。

7、生物材料，無論是永久的還是可降解的，天然的或者合成的，都需要具有良好的生物相溶性，最好能具有骨誘導(dǎo)，骨傳導(dǎo)功能，能與天然骨很好的結(jié)合，并且具有相似的力學(xué)性能。這些材料需要能為細(xì)胞的吸附提供錨點(diǎn)，具有很好的力學(xué)穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)性，并且在體內(nèi)能提供一個(gè)對(duì)生理或者生化改變響應(yīng)的界面，能夠重塑細(xì)胞外基質(zhì)以更好的和天然骨組織融合。在骨組織工程中使用得比較多的支架材料有羥基磷灰石，聚a羥基酯，以及一些天然高分子，比如明膠和殼聚糖。一般來說，支架必須使用具有良好生物相容性的材料制備，避免材料在植入體內(nèi)產(chǎn)生免疫或炎癥反應(yīng)等。對(duì)于又大分子制備的聚合物來說，支架的降解最好能和特定組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，組織的形成保持一致

8、。對(duì)于投遞干細(xì)胞而言，羥基磷灰石，磷酸鈣以及生物陶瓷都具有非常好的刺激細(xì)胞分化，誘導(dǎo)骨組織生成的功能。但是，羥基磷灰石以及磷酸鈣并不是自己具有骨誘導(dǎo)功能，并且也容易被機(jī)體緩慢的吸收。甚至它們?cè)谧鳛楣钦T導(dǎo)因子載體的時(shí)候，由于他們的生物降解性質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致一些炎癥反應(yīng)或者免疫反應(yīng)。為了避開這些限制，一些天然的或者合成的可降解材料復(fù)合構(gòu)成的支架，比如聚乳酸，聚乙醇酸及其共聚物被發(fā)展起來。廉乳靛.聚乙醇酸及其共聚物monomerpolymery二二22S=JT。=3540”匚jI40-55%cry如Mindy%/*,rVAdpprovedJLLq二/葭，wr?_岫-c品曜醇累含物防,-.J./口，忡是不同

9、而不同L,L-laqtide0月山口出看DrL-lactideJDAapprct州燃口氣時(shí)嘩白土。第46*C加聚己內(nèi)酯F聚h4二氧環(huán)己蘸monomerpolymermonomerl=115TnTO-0yJ酩=PT,-*C55%wlltnity40%crystalllnRFDAApprovedFDAApproved這些聚合物目前主要用在整形外科裝置上，比如縫合線，骨螺釘?shù)取＿@類材料已經(jīng)被FDA比準(zhǔn)，很容易進(jìn)行化學(xué)方面的修飾，他們的降解速度也很容易控制?？山到馍锊牧现Ъ茉陂_始能為組織的形成提供一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并且在組織形成時(shí)逐步降解掉，這樣可以為組織的形成和細(xì)胞外基質(zhì)的形成提供空間。它們很容易制

10、備成具有需要孔徑的三維多孔支架，以及和缺損部位具有一致形狀的修補(bǔ)物。它們可以單獨(dú)使用，或者與一些生長(zhǎng)因子，或者一些具有骨誘導(dǎo)能力的材料，比如羥基磷灰石，磷酸鈣進(jìn)行復(fù)合使用。盡管他們具有這些優(yōu)異的性質(zhì)，但是它們也具有一些容易讓人忽視的缺點(diǎn)，即不能提供很好的機(jī)械力學(xué)性能，降解產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致一些免役或者炎癥反應(yīng)。一般來說，聚乳酸等聚a羥基酯類的聚合物容易產(chǎn)生崩解，聚合物的分子量會(huì)隨時(shí)間的開始降低，當(dāng)然降解的速度會(huì)取決于支架植入的環(huán)境。但是支架的質(zhì)量在聚合物沒有降解到可以自由的擴(kuò)散之前不會(huì)有明顯的變化。這種現(xiàn)象被很多課題組研究過，一般認(rèn)為這是由于此類聚合物降解時(shí)的自催化作用導(dǎo)致的，即降解產(chǎn)生的酸性小分子，

11、在局部能促進(jìn)支架的降解。在體內(nèi)，釋放出的小分子會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。如果周圍組織不能很好的消除這些副產(chǎn)物，比如血管化不良，代謝不旺盛，那么這些副產(chǎn)物可能會(huì)導(dǎo)致局部組織的壞死。這可能是由于副產(chǎn)物導(dǎo)致的局部滲透壓升高或者PH條件變化導(dǎo)致的。與三磷酸鈣，羥基磷灰石以及一些其他的堿性的鹽復(fù)合制備的雜化或者復(fù)合材料能改善這些材料的生物相性以及與這些硬組織的相互作用。同時(shí)，TCM者HA被吸收時(shí)產(chǎn)生的堿性化合物能緩沖這些材料降解時(shí)產(chǎn)生的酸性化合物來避免形成不適合細(xì)胞生長(zhǎng)的過酸性的微環(huán)境。另外的一種策略就是在使用天然的支架材料，因?yàn)檫@種天然的支架材料是經(jīng)過自然的選擇，具有好的物理或者生理性質(zhì)。制造方法目前在制備三維

12、多孔組織工程支架上有大量的方法，一般傳統(tǒng)的方法有纖維粘合法，溶劑鑄造法，粒子浸出法，膜迭片法，冷凍干燥法以及熔融鑄造法等。溶劑鑄造法，一般會(huì)結(jié)合粒子浸出法一起使用，一般只能用來制備膜或者非常薄的支架，這是因?yàn)樘竦慕Y(jié)構(gòu)將使得可溶性粒子的滲出變得困難。Mikos等人使用這種溶劑鑄造法，制備了多孔的片狀材料，然后使用氯仿作為粘合劑，制備多孔的支架，但是這種方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且制備的支架連通孔也不是非常多，并且在制備過程中要用到有毒的溶劑。另外一種比較新的方法是使用超臨界流體技術(shù)，這種技術(shù)經(jīng)常被用來制造泡沫或者其他多孔性的產(chǎn)品。使用這種方法要求聚合物有比較高的非品比例。但是使用這種方法制備的支架只

13、有1030%勺連通孔結(jié)構(gòu)。Whang等人通過冷凍干燥聚合物乳液的方法制備了多孔性的脂肪族聚酯類化合物支架，使用該方法制備的支架孔隙率在90%Z上，中等孔徑的范圍為15到35微米，而大孔可以達(dá)到200微米。同時(shí)，支架的空具有很高的連通結(jié)構(gòu)，適合組織在材料內(nèi)部生長(zhǎng)。但是這種乳液冷凍干燥法受操作者以及技術(shù)裝備的影響很大，這種多空的連通結(jié)構(gòu)決定于實(shí)驗(yàn)操作的方法以及使用儀器的參數(shù)。還有一些研究機(jī)構(gòu)使用熱誘導(dǎo)的相轉(zhuǎn)變方法來制備三維多孔支架。這種方法以前主要用來制備藥物釋放體系和微球，一般來說可以通過改變聚合物的種類，聚合物濃度，轉(zhuǎn)變溫度以及溶劑來調(diào)節(jié)支架的孔大小。但是這種方法和乳液的冷凍干燥法相似，對(duì)操作

14、者以及技術(shù)手段依賴性很強(qiáng)。另外一些紡織方面的技術(shù)也可以用來制備具有高空隙率的支架，比如無紡布結(jié)構(gòu)，但是這種方法制備的支架不能用來承受外力。上面介紹的方法除了迭片法之外，都只適合用來制備比較薄的結(jié)構(gòu)，而如果需要制造可用于移植的支架物，目前主要采用快速成型技術(shù)，比如三維打印技術(shù)（3DP）和熔融成形技術(shù)（FDM）。三維打印技術(shù)最初由MIT建立起來，這種技術(shù)也是通過逐層打印的方法建立起來的，使用將該方法和計(jì)算機(jī)聯(lián)用可以制備出和病人缺損部位一致的移植物，但是因?yàn)樵摲椒ㄒ褂帽容^高的溫度，所以在制備的時(shí)候不能得到和生長(zhǎng)因子復(fù)合的支架材料。同時(shí)該方法對(duì)材料的選擇也比較苛刻，只有很少量的材料適合該方法。熔融成

15、形技術(shù)，這種方法是通過XY控制的加熱頭來送出熔化的材料于基體或已固化的材料上，由于底層材料較冷，從而使熔化的材料沉積固化.這樣逐層，逐帶生成出所需要的零件。目前一些研究小組可以使用這種方法來制備一些具有潛在應(yīng)用價(jià)值的生物材料支架，比如PCL以及PCL和HA的復(fù)合體系。生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子是一種由特定細(xì)胞株分泌的細(xì)胞素，它們的功能是作為一種信號(hào)分子。它們可以通過促進(jìn)或者抑制蛋白，生長(zhǎng)因子以及受體的合成來促進(jìn)或者抑制細(xì)胞黏附，增值，遷移以及分化。這些生長(zhǎng)因子對(duì)于組織的形成來說是十分必要的，在組織工程中發(fā)揮重要的作用。與骨再生和成骨細(xì)胞相關(guān)的很多生長(zhǎng)因子也在實(shí)際體系得到應(yīng)用。在骨組織工程中，主要的一些生長(zhǎng)因子是TGFb超家族，尤其是骨形成蛋白BMPs自從1988年BMP破Wozney克隆后，大致有30種類型的分子被鑒定出來，并且在臨床上得到應(yīng)用。但是雖然人重組BMPs已經(jīng)在商業(yè)上應(yīng)用十多年，但是它們臨床上對(duì)骨組織的誘導(dǎo)以及再生作用仍然不是很清楚。對(duì)這些蛋白或者序列而言，缺少適合的載體來進(jìn)行投遞，保持生物活性也極大的限制了它們的應(yīng)用。另外一種比較流行的方法就是使用