血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的實驗研究

1、血管告急素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的實行研究張建鄂,羅昌霞,張慶紅,李濤摘要目的:研究血管告急素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的機制。要領(lǐng):血管告急素10-7l/l參加腎小管上皮細胞為比擬組；體外造就的腎小管上皮細胞作為空缺比擬；差異濃度纈沙坦10-6l/l、10-7l/l、10-8l/l、10-9l/l先與腎小管上皮細胞配合造就半小時后再參加血管告急素10-7l/l為干預(yù)組；ESA、RT-PR別離檢測差異時限NF-B活性、骨橋卵白RNA表達。效果:血管告急素可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞內(nèi)NF-B活性增長，骨橋卵白RNA表達上調(diào)；而差異濃度纈沙坦干預(yù)組檢測效果表現(xiàn)NF-B活性、骨橋卵白RNA表達顯著下調(diào)。結(jié)論:

2、血管告急素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷與導(dǎo)致腎小管上皮細胞內(nèi)NF-B活性增長、骨橋卵白RNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)有關(guān)。這一歷程大概依靠血管告急素型受體。關(guān)鍵詞血管告急素;腎小管上皮細胞;核轉(zhuǎn)錄因子-B;骨橋卵白Abstrat：bjetiveTexplretheehanisfangitensininduingtheinjuryfprxialtubularells.ethdsulturedellsereinubatedithAngitensin10-7l/lasthentrl;ulturedellsereinubatedithdifferentnentratinXiesartanfrhalfanhurandthen

3、ithangitensin10-7l/lastheinterventingrup;prxialtubularellsithutstiulatinasblankntrl;ESA,RT-PRereusedtbserveNF-BativityandPNRNAexpressinindifferentperids,respetively.ResultsAngitensinuldinreaseNF-BativityandupregulatePNRNAexpressininprxialtubularells.hileXiesartanulddereaseNF-BativityanddnregulatePNR

4、NAexpressininangitensinstiulatedprxialtubularells.nlusinTheehanisfangitensininduingtheinjuryfprxialtubularellsisrelatedtinreaseNF-BativityandupregulatePNRNAexpressin,andthispressisangitensinreeptrdependent.Keyrds:Angitensin;Prxialtubularell;NF-B;PN比年來，腎臟局部腎素血管告急素醛固酮體系RAS在慢性腎臟病的產(chǎn)生、生長中的緊張作用越來越受到人們的存眷。

5、RAS的重要效應(yīng)因子血管告急素Angitensin已創(chuàng)造與很多腎臟疾病的產(chǎn)生、生長歷程嚴密相干。但血管告急素可否誘導(dǎo)小管上皮細胞損傷及其詳細機制不明。本課題通過體外實行用必然濃度血管告急素刺激腎小管上皮細胞，不雅察核轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子的變革，探究血管告急素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的大概機制。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要試劑及儀器測定NF-B活性的ESA試劑盒prega公司；血管告急素siga公司；RT-PR試劑盒BDBisiene公司；TRIZLGiB公司；RNaseA按捺劑Nvagen公司；引物上海生工生物工程技能公司；大鼠的腎小管上皮細胞株(NRK細胞)購至中科院上海細胞庫；冷凍離心機Bifuge

6、公司，二氧化碳溫箱Frasientifi公司。纈沙坦由北京諾華公司提供。1.2細胞造就無菌條件下大鼠腎小管上皮細胞株，0.25%胰酶消化2in，不雅察細胞疏散成拉網(wǎng)狀，停頓消化，參加RPI1640造就液含20%胎牛血清，300g/l谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素重復(fù)吹打，并分裝至造就皿，置于37二氧化碳溫箱中孵育；重復(fù)傳代，取第七代細胞實行用。1.3實行分組當傳代細胞長至90%融適時換無血清造就液繼承造就12h。試驗分組如下：空缺比擬:未加刺激物的造就細胞。比擬組:血管告急素10-7l/l參加造就細胞，別離于12、24h檢測NF-B活性；12、24h檢測骨橋卵白RNA表達程度；每個檢測指標均設(shè)五個重

7、復(fù)組。干預(yù)組:差異濃度纈沙坦10-6l/l、10-7l/l、10-8l/l、10-9l/l參加造就細胞，半小時后再參加血管告急素10-7l/l，別離于12h檢測NF-B活性；12h檢測骨橋卵白RNA表達程度；每個檢測指標均設(shè)五個重復(fù)組。1.4ESA的操縱步調(diào)核卵白的提取Bradfrd法定量。ESA的操縱依試劑盒說明書at#3050舉行NF-B寡核苷酸探針r-32pATP標識表記標幟及ESA法測定NF-B活性。NF-B同序寡核苷酸探針序列為3-TAATTGAAAGGGTG5；5-AGTTGAGGGGATTTAGG-3。反響竣事后，在4%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳2h電壓150V，電泳緩沖液為0.

8、5TBE。電泳完畢后干膠，-70放射自顯影。電泳效果經(jīng)密度掃描儀舉行半定量闡發(fā)。1.5骨橋卵白的RT-PR操縱步調(diào)造就細胞接種至12孔造就板，當細胞長至80%90%融適時換無血清造就液，12h后按試驗分組加藥物干預(yù)，每組細胞均設(shè)五個復(fù)孔。TRIZL提取總RNA，并測定濃度及260/280n的吸光度A值。按T1TANIUTne-stepRT-PR試劑盒說明舉行操縱。反響條件：501h，905in；9430，6530，681in30個循環(huán)；68延伸2in，4保存。骨橋卵白上游引物序列：5AAGTGAATTAGAA3；骨橋卵白卑劣引物序列為：5GAATGGGATGATTGAT3，產(chǎn)物長度446bp；

9、設(shè)-atin為內(nèi)參照，其上流引物序列為5-TGTAATGGATTGTGA-3，卑劣引物序列為5-TTGTTGTGATAAT-3，產(chǎn)物長度545bp。ark片斷選用2000bp。電泳闡發(fā):取8lPR擴增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為1.5g/l的瓊脂糖凝膠上電泳，接納kdaksieue凝膠圖像闡發(fā)體系掃描，并闡發(fā)電泳條帶，以PN與-atin的電泳條帶光密度比值來作為PNRNA的相對表達量。1.6統(tǒng)計學處置懲罰全部實行數(shù)據(jù)接納均數(shù)尺度差xs表現(xiàn)，差異的明顯性接納單因素方差闡發(fā)及q查驗，以P0.05為差異有明顯性。2效果2.1ESA法測定效果(見圖1)圖1中17泳道的密度掃描值依次為：36.308.73,194.

10、5010.45,186.3012.30,76.344.57,90.345.86,114.607.67,138.416.53；n=5每組細胞均設(shè)五個重復(fù)組。未加刺激的腎小管上皮細胞內(nèi)NF-B表達較弱；血管告急素10-7l/l刺激腎小管上皮細胞后NF-B活性顯著增高，以12h最顯著，為空缺比擬的5.47倍P0.05；24h為空缺比擬的4.97倍P0.05；差異濃度纈沙坦12h可按捺血管告急素刺激的腎小管上皮細胞內(nèi)NF-B活性，按捺作用依次為10-6l/l10-7l/l10-8l/l10-9l/lP0.05。圖1各組NF-B活性的變革略注:1.空缺比擬；2.血管告急素10-7l/l12h；3.血管告

11、急素10-7l/l24h；4、5、6、7泳道別離為10-6l/l12h、10-7l/l12h、10-8l/l12h、10-9l/l12h；2.2骨橋卵白RT-PR檢測效果(見圖2)17泳道PN與-atin的電泳條帶的光密度比值依次為：17泳道依次為0.200.05，0.970.049，0.850.014，0.170.032，0.370.017，0.600.031，0.280.012；n=5；顛末統(tǒng)計學闡發(fā)，各組及組間比擬均有明顯差異，P0.05。從效果闡發(fā)：未加刺激的腎小管上皮細胞內(nèi)骨橋卵白轉(zhuǎn)錄較弱，而血管告急素10-7l/l誘導(dǎo)腎小管上皮細胞內(nèi)骨橋卵白轉(zhuǎn)錄增長，12h達岑嶺，并連續(xù)至24h；

12、差異濃度纈沙坦可按捺血管告急素刺激的腎小管上皮細胞骨橋卵白的轉(zhuǎn)錄程度，按捺作用依次為10-6l/l10-7l/l10-9l/l10-8l/lP0.05。圖2各組PNRNA程度的變革略注：:DNAark；1、空缺比擬;2、血管告急素10-7l/l12h；3、血管告急素10-7l/l24h；4、5、6、7泳道別離為纈沙坦10-6l/l12h、10-7l/l12h、10-8l/l12h、10-9l/l12h。3討論腎臟局部腎素血管告急素醛固酮體系RAS在慢性腎臟病希望中的作用已倍受器重，血管告急素轉(zhuǎn)化酶按捺劑和血管告急素受體拮抗劑應(yīng)用臨床及動物實行研究證明，血管告急素在小管間質(zhì)病變中發(fā)揮緊張作用1。

13、比年來，大量研究效果表白2，腎小管間質(zhì)病變較腎小球病變動嚴密相干于腎成效的損傷和預(yù)后。小管間質(zhì)病變在舉行性腎小球損傷中的緊張性已經(jīng)被越來越多的國表里學者所器重。在小管間質(zhì)損害歷程中腎小管上皮細胞飾演著緊張的腳色。但血管告急素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的詳細機制不明。NF-B作為一種緊張的核轉(zhuǎn)錄因子，能與多種基因啟動子或加強子上的B位點產(chǎn)生特異性結(jié)合，并促進基因轉(zhuǎn)錄，到場很多基因，尤其是炎癥與免疫相干基因的表達與調(diào)控。很多刺激，如：腫瘤壞死因子TNF-、高糖、血小板活化因子、細胞因子等可激活NF-B3。NF-B游離并移入核內(nèi),調(diào)控炎癥與免疫相干的基因的表達。在胞漿中還存在另一種卵白質(zhì)家屬-IB，它的

14、重要作用是與NF-B/Rel卵白在胞漿中結(jié)歸并使后者保持靜息狀態(tài)。NF-B在核內(nèi)與新合成的IB結(jié)合后出核，進入胞漿，從而失活。本課題通過體外實行用血管告急素10-7l/l刺激腎小管上皮細胞，ESA檢測效果表現(xiàn)NF-B活性升高，12h達岑嶺，并連續(xù)至24h，說明必然濃度血管告急素可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞NF-B活性升高，與隨后的炎癥、纖維化基因的過分表達嚴密相干。骨橋卵白是一種可以在腎小管上皮表達的高度酸化的磷卵白，現(xiàn)以為它是巨噬細胞趨化因子。而在很多病腎實行模子上包羅缺血再灌注損傷創(chuàng)造其表達上調(diào)。如今針對臨床腎臟疾病的研究創(chuàng)造骨橋卵白在伴有卵白尿的腎小球疾病如微小病變性腎并膜性腎并IgA腎病的腎小

15、管上皮細胞處高表達，均與小管間質(zhì)纖維化嚴密相干4-5。本研究通過體外實行用血管告急素10-7l/l刺激腎小管上皮細胞，RT-PR效果表現(xiàn)配合造就后骨橋卵白的轉(zhuǎn)錄增長，在12h達岑嶺并連續(xù)至24h，與血管告急素10-7l/l誘導(dǎo)腎小管上皮細胞內(nèi)NF-B活性改變一樣等，證明血管告急素10-7l/l可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞內(nèi)骨橋卵白的轉(zhuǎn)錄增長，這大概與腎小管間質(zhì)巨噬細胞浸潤有關(guān)。通過對差異濃度纈沙坦配合造就的腎小管上皮細胞的測定，在雷同刺激下其NF-B活性及骨橋卵白的轉(zhuǎn)錄程度顯著低落，從實行角度說明纈沙坦用于慢性腎臟病的治療機制與按捺血管告急素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞內(nèi)NF-B活性及骨橋卵白的轉(zhuǎn)錄程度有關(guān)，

16、因纈沙坦屬血管告急素型受體拮抗劑，我們推測血管告急素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞NF-B及PNRNA活性上調(diào)依靠于血管告急素型受體。通過本研究證明血管告急素可誘導(dǎo)小管上皮細胞內(nèi)NF-B活性顯著增長，骨橋卵白轉(zhuǎn)錄增長，與炎性細胞小管間質(zhì)浸潤嚴密相干，而且這一歷程依靠AGN型受體。但詳細的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍需深化研究。參考文獻1LaiKN,hanLY,TangS,etal.esangialexpressinfangitensinreeptrinIgAnephrpathyanditsregulatinbyplyeriIgA1J.KidneyInt,2022,66(4):1403-1416.2DruK,BauerB

17、,FreudingerR,etal.AlbuininduesNF-kappaBexpressininhuanprxialtubule-derivedells(IHKE-1)J.ellPhysilBihe，2002,12(4):187-196.3TitaN，rishitaR，TitaS,etal.InhibitinfTNF-alpha,induedytkineandadhesinleule:expressininglerularellsinvitrandinvivbytransriptinfatrdeyfrNFkappaBJ.ExpNephrl,2001,9(3):181-190.4KairiJY,Ta