乳酸菌的篩選與鑒定流程

1、1. 材料 首先要確定目標，即所篩選的乳酸菌來自哪里，例如想要篩選一株果蔬發(fā)酵 乳酸菌，那我們就得找一個產(chǎn)區(qū)或者其他地方自然發(fā)酵果蔬的樣品。1.1培養(yǎng)基 查找相關(guān)文獻，菌種生化鑒定用培養(yǎng)基建議查看文獻：工業(yè)微生物實驗手冊MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L,蛋白胨10 g/L，吐溫801g/L,葡萄糖50 g/L, 乙酸鈉5g/L,硫酸鎂0.2 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,檸檬酸二銨2 g/L,溴甲基酚紫 0.4 g/L，酵母提取物5 g/L,瓊脂1520 g/L, pH 6.36.7, 121 C濕熱滅菌30 min。（PS：若自己嫌麻煩，可買現(xiàn)成的MRS培養(yǎng)基）初篩培養(yǎng)基:在MRS分離培養(yǎng)基

2、的基礎(chǔ)上，添加0.5%碳酸鈣，乳酸調(diào)至PH2.0.加碳酸鈣是為了能更好的挑出優(yōu)勢菌,乳酸調(diào)至 PH2.0 也是同樣道理）如圖：若是乳酸菌菌落旁會有清晰可見的透明圈,這是由于乳酸與碳酸鈣反應(yīng)了。高鹽復(fù)篩培養(yǎng)基:在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加10%氯化鈉和0.5%碳酸 鈣。高糖復(fù)篩培養(yǎng)基:在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將葡萄糖質(zhì)量分數(shù)提高到30%, 添加 0.5%碳酸鈣。明膠培養(yǎng)基:蛋白胨25 g/L，牛肉膏7.5 g/L，氯化鈉5g/L，明膠100 g/L, pH7.0 7.2, 121：濕熱滅菌 15 mi n。果蔬發(fā)酵培養(yǎng)基:將蘋果、胡蘿卜、西瓜、西紅柿等水果、蔬菜清洗去皮切 分后分別榨汁除渣

3、制得發(fā)酵果醬，然后按1：1：1：1比例混合經(jīng)巴氏滅菌后4 :冷 藏。按照混合果蔬汁 33.3%、葡萄糖 5%、蔗糖 5%、氯化鈣 0.5%、磷酸氫二鈉0.05%、磷酸二氫鈉 0.05%、硫酸鎂 0.03%、檸檬酸 0.1%的配比配制，除果蔬和 檸檬酸外其余成分于115 :濕熱滅菌15 min。2. 方法乳酸菌的分離篩選取產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵蘋果原漿，用 0.9%滅菌生理鹽水進行 10 倍梯度稀釋后，吸 取適宜稀釋度溶液涂布至MRS分離培養(yǎng)基中，37 :恒溫厭氧培養(yǎng)24h,挑取菌落 黃色范圍大并具有乳酸菌典型特征的單菌落，進行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。將 革蘭氏染色陽性菌落接種于MRS培養(yǎng)基,37：恒溫厭

4、氧培養(yǎng)24 h,重復(fù)劃線培養(yǎng), 連續(xù)傳代培養(yǎng)不少于 3 次，直至得到單菌種純培養(yǎng)物，作為乳酸菌備選菌株。將備選菌株分別接種在初篩培養(yǎng)基，37 :恒溫厭氧培養(yǎng)24h，然后挑選目標 菌落繼續(xù)在高鹽復(fù)篩培養(yǎng)基中進行篩選,挑選黃色鈣圈明顯的單菌落繼續(xù)點接在 高糖復(fù)篩培養(yǎng)基，37 :恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，挑取明顯變黃的菌落轉(zhuǎn)至MRS固體斜 面,低溫保藏備用。乳酸菌的鑒定2.2.1 形態(tài)學鑒定菌落形態(tài)：將菌株活化后接種在MRS固體平板上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài);革蘭 氏染色：將菌株進行革蘭氏染色觀察菌體細胞形態(tài)。耐受性分析將菌株甘油凍存管分別活化至菌體濃度調(diào)至2.5x108CFU/mL,然后分別接種 于pH 2

5、.03.0、NaCI質(zhì)量分數(shù)5.0%10.0%或葡萄糖質(zhì)量分數(shù)10.0%30.0%的 MRS 液體培養(yǎng)基， 37 ：恒溫培養(yǎng)，于 0 h 和 3 h 分別取樣進行活菌計數(shù)，以 0 h 樣品為對照，按式（1）計算樣品中菌株的存活率：存活料盲詼蘇/髓(I)存活料盲詼蘇/髓(I)2.2.3 生理生化鑒定 對分離菌株進行過氧化氫酶反應(yīng)、硫化氫、明膠液化、吲哚產(chǎn)生、石蕊牛乳、 乳酸紙層析以及碳水化合物利用等實驗，結(jié)果對照伯杰細菌鑒定手冊進行綜 合評定。過氧化氫酶反應(yīng)：將篩選菌株接于 MRS 斜面培養(yǎng)基上， 37：培養(yǎng) 24h 后，滴 加幾滴過氧化氫溶液，觀察是否產(chǎn)生氣泡。硫化氫實驗:將篩選菌株接種于三糖

6、鐵瓊脂培養(yǎng)基中，20 :培養(yǎng)7d觀察是否 變黑。明膠液化實驗：將篩選菌株接種于明膠培養(yǎng)基試管，20 :培養(yǎng)觀察菌生長情 況及明膠是否融化。吲哚實驗:將篩選菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 :培養(yǎng)24 h，后加入乙 醚和吲哚試劑，觀察液層界面呈現(xiàn)玫瑰色則為陽性，否則為陰性。石蕊牛乳實驗:將篩選菌株接種于石蕊牛乳試管中，37：培養(yǎng)1、3、5、7、 14 d觀察有無酸凝、酶凝、胨化、還原等現(xiàn)象。乳酸紙層析實驗：將篩選菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液、 2%乳酸及空白培養(yǎng)液點在濾紙 上,放入裝有展層劑（水-正丁醇-苯甲醇體積比為1：5：5）的層析缸，約10h后， 取出濾紙風干。向濾紙均勻噴灑0.04%溴酚藍乙醇溶液顯

7、色，對比樣品與乳酸所 出現(xiàn)黃色斑點位置，計算 Rf 值以判斷樣品中是否含有乳酸。碳水化合物利用實驗：將篩選菌株接入各種碳水化合物培養(yǎng)試管， 37：恒溫培 養(yǎng)24h，觀察試管中培養(yǎng)物顏色變化及有無氣體產(chǎn)生。2.2.4菌株的16S rRNA分子鑒定將篩選菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司測定16S RNA序列。2.2.5 乳酸菌發(fā)酵性能測定將篩選出的耐酸、耐鹽、耐糖菌株進行活化、擴培后，按 5%接種量分別接 種于果蔬發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37：恒溫厭氧培養(yǎng)，定時取樣，測定各發(fā)酵時間點的生 物量、活菌數(shù)、pH值、酸度等（自發(fā)酵始每隔3 h測定生物量、pH值和酸度， 每隔12 h測定活菌數(shù)），每次測定

8、重復(fù)3次。生物量:測定樣品在600 nm波長處的OD值，根據(jù)時間和OD值繪制菌株生 長曲線;菌體干質(zhì)量:定量取5 mL菌體烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量計算;pH值:采用 pH 計直接測定;活菌數(shù)：采用伊紅美藍活菌數(shù)快速測定方法測定;酸度（以乳酸濃 度計）:采用酸堿滴定法測定328，具體步驟如下:吸取果蔬發(fā)酵液10 g，用 0.1mol/L NaOH 標準溶液滴定并邊滴定邊攪拌測定 pH 值，滴定至 pH 值為 8.2， 記錄標準NaOH用量，同時做空白對照，按式（2）計算發(fā)酵液酸度：酸filr IpnioL/L）式中：C為汕1OH標準溶液的餓度/（RL011） i F為嫡坯至pH &2時港耗的NaOH潯液弟用訊局L；疋沖乳蔗轉(zhuǎn)化艇 0曲；岀為呱馭&薛溉怵積如L.2.3 數(shù)據(jù)分析所有實驗均設(shè)置 3 次重復(fù)，實驗結(jié)果采用 SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析。圖表采 用 OriginPro8.0 進行