ctDNA檢測技術(shù)學(xué)習(xí)資料

1、精品文檔精品文檔ctDNA檢測技術(shù)循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)來源于腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死或分泌產(chǎn)生的DNA片段，是循環(huán)游離DNA(circulatingcell-freeDNA,cfDNA)W一部分1。ctDNA含有與其來源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點突變，重排，擴增等2；其在血液中的半衰期短，可實時反映腫瘤的動態(tài)變化3;作為液體活檢的一種，可克服組織活檢中由于腫瘤異質(zhì)性帶來的缺陷，檢測更全面4,因此ctDNA的檢測可用于癌癥早期診斷與癌癥分期、腫瘤的療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷等。由ctDNA的質(zhì)量和數(shù)量變化大，因此需要高特異性和高靈敏度的檢測方法。

2、目前常用的方法有數(shù)字PCR(digitalPCR,dPCR)、BEAMing(bead,emulsion,amplificationandmagnetic)、高通量測序(nextgenerationsequencing,NGS)、ARMS等6。1.數(shù)字PCR1999年Vogelstein等提出了數(shù)字PCR(digtalPCR,dPCR)的概念。數(shù)字PCR包括兩部分，即PCR擴增和熒光信號分析。先將是樣品稀釋后分配到大量微小的反應(yīng)單元中，每個單元包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子,然后分別對目標(biāo)分子進(jìn)行擴增，擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集。數(shù)字PCR采用直接計數(shù)的方法進(jìn)行定量分析,

3、有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子，記為1，無熒光信號的則即為0，理論上，在樣品中極限稀釋的情況下，有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)。但是有的反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子，這時需要用泊松概率分布公式進(jìn)行計算8。不同于傳統(tǒng)的qPCR技術(shù)，數(shù)字PCR不受擴增曲線的循環(huán)閾值(CT)和擴增效率的影響，無需參照，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可實現(xiàn)絕對定量分析9。根據(jù)反應(yīng)單元類型不同，數(shù)字PCR分為三類：微反應(yīng)室/孔板數(shù)字PCR、微流控芯片和微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。微反應(yīng)室/孔板數(shù)字PCR借助高通量自動上樣設(shè)備和增加的反應(yīng)單元數(shù),實現(xiàn)快速精確取樣，提高檢測靈敏度。微流控芯片

4、技術(shù)是一種基于含有數(shù)千個超高密度親疏水微孔芯片的dPCR平臺，可實現(xiàn)高通量、低成本分析。微滴數(shù)字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)是將含有目標(biāo)分子的樣品分成成千上萬個納升級的油包水微滴，再對每個微滴進(jìn)行擴增，和熒光信號的采集，更容易實現(xiàn)小體積和高通量10。數(shù)字PCR可絕對定量，是目前靈敏度最高的檢測技術(shù)，但其也存在一定缺點，如生成的微滴必須服從泊松分布，所以不適合高濃度DNA樣本檢測，；只能檢測已知的突變且一次只能檢測一種突變11,12。2.BEAMing技術(shù)BEAMing技術(shù)在檢測ctDNA內(nèi)體腫瘤突變具有非常高的靈敏度，它是結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)的一種檢測方法，

5、最早是由BertVogelstein提出。其方法是每一類DNA分子都會專一的與磁性珠相連接，然后DNA分子之間的差異可以通過流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記來做出評估。這種方法是基于小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴增(Amplification)、磁性(Magnetic)，這四個主要組分來構(gòu)建的，所以被稱作為BEAMing。BEAMing技術(shù)的過程包括：首先是分離和純化血漿中的DNA；接著是預(yù)擴增步驟，通過使用常規(guī)PCR擴增目的基因片段，使用引物與已知的標(biāo)記序列混合;然后，這些DNA模板再通過乳液PCR擴增，應(yīng)用引物探測這些序列，通過鏈酶親和素磁珠相互作用與有磁性的微膠珠結(jié)合。通過這種方

6、式設(shè)計的系統(tǒng)，在反應(yīng)結(jié)束之前，每個乳液液滴中生成的PCR產(chǎn)物將保持對微膠珠的附著性，使其可以很容易地通過磁性進(jìn)行分離和純化14。并且，BEAMing技術(shù)是利用磁珠來吸附游離DNA，它可以從1萬個健康細(xì)胞DNA中檢測出那一個ctDNA分子，具有較高的敏感性，同時在很多研究中其在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的突變都和ctDNA部分突變是一致的15,16。BEAMing技術(shù)相比其他檢測技術(shù)具有很多優(yōu)勢：(一)在常規(guī)實驗室條件下，數(shù)以萬計的DNA分子可以通過該種方法來進(jìn)行評估。(二)特異的突變可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離篩選以備進(jìn)一步分析和研究。(三)BEAMing技術(shù)可以用來對特定組織或者人群中罕見的突變，以及研究一般基因序列或轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物的變異都可以提供相應(yīng)的鑒別和定量分析。由于外周血流中ctDNA拷貝的數(shù)量是很低的，特別是相較于野生型DNA來說。出于這個原因，使用PCR進(jìn)行DNA擴增是B