克羅諾氏菌檢測-甘辛課件

1、食品中克羅諾桿菌屬（ Cronobacter,原阪崎腸桿菌）檢測國家食品安全風險評估中心甘 辛命名演變阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）莫金斯克羅諾桿菌（C.muytjensii）克羅諾桿菌基因種1（C.genomospecies 1）都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis）都柏林亞種（C.dublinensis subsp.dublinensis）洛桑亞種（ C.dublinensis subsp.lausannensis）奶粉亞種（ C.dublinensis subsp.lactari

2、di）阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）莫金斯克羅諾桿菌（C.muytjensii）尤尼沃斯克羅諾桿菌（C. universalis）都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis）都柏林亞種（C.dublinensis subsp.dublinensis）洛桑亞種（ C.dublinensis subsp.lausannensis）奶粉亞種（ C.dublinensis subsp.lactaridi）康帝蒙提克羅諾桿菌(C.condimenti)分類變化2008年2011年克羅諾桿菌屬及親緣關系

3、較近的腸桿菌生化反應比較試驗生化反應克羅諾桿菌屬陰溝腸桿菌產氣腸桿菌成團腸桿菌日勾維腸桿菌賴氨酸脫羧酶精氨酸雙水解酶鳥氨酸脫羧酶KCN生長v發(fā)酵:蔗糖()衛(wèi)矛醇()()核糖醇()棉子糖vD-山梨醇v-甲基-葡萄糖甙()D-阿拉伯糖醇()黃色素()注： ：90-100；() ：75-89%； V ：25-74；()：10 -24； ：0-9分布及致病性乳品安全標準（報批稿）嬰兒配方食品特殊醫(yī)學用途配方食品 0-6個月齡我國對嬰幼兒食品中該菌的規(guī)定1988年，Muytjens檢測了35個國家的141種嬰兒配方粉，其中13個國家的20種抽檢樣品中分離到克羅諾桿菌，占全部樣品的14.2%。2001年4

4、月美國田納西州發(fā)生克羅諾氏菌感染來自于嬰幼兒配方粉。2004年Iversen等調查了82個嬰幼兒配方乳粉和404個其他的食品中存在克羅諾氏菌、沙門氏菌和其他腸桿菌的情況，結果發(fā)現在嬰幼兒配方乳粉、干嬰兒食品、奶粉、干酪和其他產品中，克羅諾桿菌檢出率分別為2.4%、10.2%、4.1%、和3.2%2002年香港食物環(huán)境衛(wèi)生署從德國美樂寶HN25奶油粉檢出克羅諾桿菌2002年美國FDA從費蒙特工廠生產的嬰幼兒配方粉中檢出克羅諾桿菌克羅諾桿菌在乳粉中的分布新生兒（低出生體重等免疫力低下）早產兒老年人免疫功能低下的成年人克羅諾桿菌屬的易感人群1982年Gimenez報道1名76歲老人感染克羅諾桿菌引起

5、尿膿血癥1985年Pribyl從1名糖尿病患者足部潰瘍部分分離出克羅諾桿菌1991年Hawkins報道了1例克羅諾桿菌引起的成人菌血癥2001年Lai報道了馬薩諸塞州立大學醫(yī)學中心1995年1996年4例成人感染克羅諾桿菌，其中3名死亡2002年Dennison從1名64歲的外周血管病患者的傷口分離了克羅諾桿菌2002年Ongradi報道了1名26歲女性感染克羅諾桿菌成年人感染克羅諾桿菌病例2002年國際食品微生物標準委員會（(International Commission of Microbiological Specializations on Food，ICMSF）將阪崎腸桿菌列為“嚴

6、重危害特定人群生命、引起長期慢性實質性后遺癥的一種致病菌”。2004年世界糧農組織和WHO經過風險性評估將阪崎腸桿菌和沙門氏菌共同列為嬰幼兒配方粉A類致病菌。1、GB 4789.40-2010 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗2、SN/T 1632-2013 中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準 出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法 SN/T 1632.1-2013 分離與計數 SN/T 1632.1-2013 PCR方法 SN/T 1632.1-2013 熒光PCR方法3、ISO/TS 22964 Milk and milk productsDetection of Entero

7、bacter sakazakii 20064、USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:Cronobacter國內外檢測方法USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:CronobacterISO/TS 22964 Milk and milk productsDetection of Enterobacter sakazakii 2006SN/T 1632.1-2013 分離與計數第一法 阪崎腸桿菌的檢驗檢驗程序報 告生化鑒定挑取黃色菌落DFI瓊脂361，24 h2h挑取藍

8、綠色菌落1mL + mLST-Vm 10mL440.5，24 h2h檢樣100 g/mL+稀釋液 900 mL361，18 h2h前增菌選擇性增菌選擇性分離生化鑒定TSA251，48 h4h1、將混勻后的樣品361培養(yǎng)18h2h。2、將培養(yǎng)后的樣品充分混勻，取1mL至10mL mLST-Vm肉湯中，混勻，440.5培養(yǎng)24h2h。二、前增菌和選擇性增菌100g900mL1mL10mL1、混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌液1環(huán)，分別劃線接種于兩個DFI平板，361培養(yǎng)24h2h。2、從DFI培養(yǎng)基上挑取1個5個藍綠色可疑菌落，劃線接種于TSA平板。25 1培養(yǎng)48h4h。三、分離和鑒定TS

9、A： 25培養(yǎng)后典型菌落：黃色陰性對照E. coli ATCC 25922：白色菌落從TSA平板上挑取菌落接種生化鑒定培養(yǎng)基（國標采用生化培養(yǎng)基），保證無雜菌生長后可以將菌落制備為0.5-0.62個麥氏濃度的菌懸液后滴加，也可以直接穿刺接種，設置陽性對照。生化鑒定API 20E和VITEK 2 GN鑒定卡：目前這兩種生化條已在國內外得到廣泛應用，在BAM中也收錄作為克羅諾桿菌屬鑒定的方法。第二法 阪崎腸桿菌的計數100g10g1g900mL90mL9mL1mL1mL1mL10mL10mL10mLX 3第一法：綜合菌落形態(tài)和生化特征，報告每100g（mL）樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。第二發(fā)：

10、綜合菌落形態(tài)和生化特征，根據證實為克羅諾桿菌屬的陽性管數，查MPN檢索表，報告每100g（mL）樣品中克羅諾桿菌屬的MPN值（見附錄B中的表B.1）。結果報告PCR法和熒光PCR法：1、從液體增菌肉湯中提取DNA：目前美國USFDA BAM 2012年版方法和SN/T 1632.2-2013以及SN/T 1632.3-2013都是將增菌肉湯離心后直接提取DNA。該方法的優(yōu)點是可以快速提示克羅諾桿菌屬陽性的樣品，但缺點因為PCR法無法區(qū)別死菌和活菌，因此可能出現PCR結果陽性但無法分離出菌落的情況。四、快檢方法2、從菌落中提取DNA：從DFI平板接種TSA時同時接種BHA（腦心浸液瓊脂）平板，

11、361培養(yǎng)24h2h，挑取菌落提取DNA。該方法的優(yōu)點是在獲得菌落的同時快于生化鑒定法，另外有文獻報道個別克羅諾桿菌屬細菌在TSA上不產黃色素，因此容易漏報。缺點是增菌和分離所需時間無法縮短，同時PCR法均要避免污染造成的假陽性。抵抗力耐熱性耐酸性（pH0.92下存活與周身菌毛結構有關）滲透壓、干燥（含有大量的海藻糖酶）形成生物膜克羅諾桿菌屬可以在干燥奶粉中長期存活；一旦形成生物膜將很難徹底清除，同時更容易污染生產設備和環(huán)境。 克羅諾桿菌的防控增值能力6，21，37分別是13.7h，1.7h，1921min。克羅諾桿菌屬25放置6h該菌的相對危險性可增加30倍；25放置10h可增加30 000倍。2004年2月FAO/WHO在日內瓦召開的嬰幼兒配方粉中克羅諾桿菌屬專家研討會上提出嬰幼兒配方粉中微量的該菌（3 CFU/100g）污染也能導致感染的發(fā)生。 控制措施 控制原料的質量 加工過程中滅菌 防止滅菌后產品的二次污染 生產設備的控制 防止消費環(huán)節(jié)被污染克羅諾桿菌的控制措施控制原料來源，避免受污染的原料流入生產環(huán)節(jié)。巴氏消毒法可以有效殺滅克羅諾桿菌屬，同時也需要根據乳粉組分含