板藍(lán)根對(duì)機(jī)體免疫功能及流感病毒FM1的作用

1、板藍(lán)根對(duì)機(jī)體免疫功能及流感病毒FM1的作用【關(guān)鍵詞】板藍(lán)根；,流感病毒；,淋巴細(xì)胞；,紅細(xì)胞免疫黏附；,抗病毒作用摘要：目的研究板藍(lán)根提取物對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的影響及其抗流感病毒(F1)的作用。方法昆明種小鼠腹腔注射板藍(lán)根提取液，檢測(cè)紅細(xì)胞免疫黏附功能等各項(xiàng)免疫指標(biāo);昆明種小鼠滴鼻感染流感病毒F1后腹腔注射板藍(lán)根提取液，觀察板藍(lán)根提取液的抗病毒作用。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，板藍(lán)根組脾指數(shù)增加P0.05；T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)、RB3bR花環(huán)陽(yáng)性率都明顯增高，RBI花環(huán)陽(yáng)性率顯著降低，有顯著性差異P0.01。與陰性對(duì)照組相比，板藍(lán)根組肺指數(shù)降低P0.05，體重增加值高P0.05)。結(jié)論板藍(lán)根提取物

2、具有很強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，其進(jìn)步紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能的作用極其顯著；同時(shí)板藍(lán)根提取物也有一定的抗流感病毒作用。關(guān)鍵詞：板藍(lán)根；流感病毒；淋巴細(xì)胞；紅細(xì)胞免疫黏附；抗病毒作用Abstrat：bjetiveTstudythestrengtheningfuntinfextratfRadixIsatidisniunesysteinKuningieanditsantiviraleffetsninfluenzavirus(F1).ethdsExtratfRadixisatidisasintraperitneallyinjetedtKuningie.Lyphyteprliferatinassayand

3、rsettefratintestereusedteasuretheellulariunefuntinandhuraliunefuntinanderythrytiiuneadhesivefuntinfie.F1virusasdrppednasallyinKuningie,thentheanialserentrlintraperitneallyinjetedextratfRadixisatidis,theantiviraleffetsfRadixisatidiserebserved.Resultsparedithntrlgrup,spleenindexintheRadixIsatidisgrupi

4、nreasedF=4.578,P0.05.paredithntrlgrup,SIfTlyphyteintheRadixIsatidisgrupinreasedsignifiantlyF=15.537,P0.01,SIfBlyphyteinreasedbviuslyF=11.050,P0.01,andtheratefRB3bRasinreasedF=7.865,P0.01,t.paredithntrlgruptheratefRBIintheRadixIsatidisgrupdereasedgreatlyF=20.354,P0.01.paredithnegativegrup,Lungindexin

5、theRadixIsatidisgrupdereasedF=47.020,P0.05.ThedegreefhangeinEightfthatgrupashigherthannegativegrupF=25.877,P0.05.nlusinRadixIsatidishasstrngstrengtheningfuntinniunesysteinKuningie,itsenhaningfuntinnredelliuneadherene(RIA)isextreelysignifiant.rever，italshasantiviraleffetsninfluenzavirus.Keyrds：RadixI

6、satidis;Influenzavirus;Lyphyte;RIA;Antiviraleffets中藥板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)IsatisindigtiaFrt.的根，性寒味苦，有清熱解毒、涼血消腫的成效。隨著國(guó)際上應(yīng)用天然藥物的熱潮，板藍(lán)根的藥理活性及其有效成分得到了深化的研究，并引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但是關(guān)于板藍(lán)根制劑對(duì)紅細(xì)胞免疫功能的作用卻少有報(bào)道。1981年美國(guó)的Siegel1，2在前人研究的根底上提出了“紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)(RIS)的新概念。近20多年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紅細(xì)胞免疫功能進(jìn)展了大量研究，紅細(xì)胞的免疫功能逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，紅細(xì)胞免疫已成為近年來(lái)免疫學(xué)研究中的一個(gè)新課題

7、。1器材1.1病毒流感病毒鼠肺適應(yīng)株F1，由天津醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)提供。1.2雞胚911日齡雞胚，購(gòu)于天津市羽豐種雞常1.3藥品注射用胸腺肽：遼寧天龍藥業(yè)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20003786；鹽酸嗎啉胍片病毒唑：山西津華藥業(yè)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H14023058；板藍(lán)根提取液：安徽產(chǎn)板藍(lán)根,以70%乙醇滲漉法提齲1.4動(dòng)物昆明種小鼠雄，1416g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,答應(yīng)證編號(hào)：sxk(京)20020001。1.5試劑刀豆蛋白nA：siga分裝，批號(hào)：2022；脂多糖LPS：siga分裝，批號(hào)：L2880；TT：siga分裝，批號(hào)：2128；RPI1640培養(yǎng)基干粉：Gib分裝,

8、批號(hào)：1181499；新生牛血清NS：Hylne分裝，批號(hào)：AJ11171。1.6儀器二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)FraSientifi公司；酶標(biāo)光度計(jì)，美國(guó)BIRAD公司；電子天平，日本AD公司；B600超低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，白洋離心機(jī)廠；LDZ52平板離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SHP250B生化培養(yǎng)箱，天津天宇機(jī)電。2方法2.1F1的培養(yǎng)及其LD50的測(cè)定3911日齡雞胚30枚，采用尿囊腔接種法培養(yǎng)繁殖流感病毒，滴定血凝效價(jià)，將血凝效價(jià)為1:640的雞胚尿囊液搜集在一起，作為本次實(shí)驗(yàn)使用的F1原液。將F1原液十倍倍比稀釋，得到101，102，103，104，105濃度的病毒液。取昆明種小鼠50只，

9、隨機(jī)分5組，10只/組，乙醚輕度麻醉后，各組分別滴鼻給予以上5種濃度的病毒液50l，觀察14d，統(tǒng)計(jì)各組死亡數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。使用Reeduenh法測(cè)得此流感病毒的LD50為103.2。2.2板藍(lán)根提取液增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用2.2.1動(dòng)物分組及給藥方法昆明種小鼠30只，隨機(jī)分3組，10只/組，給藥方法見(jiàn)表1。給藥7d后，先禁食、水8h以上，稱重后摘眼球放血處死，搜集血液，并無(wú)菌解剖取胸腺和脾臟，測(cè)定胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，檢測(cè)臟器比4、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和紅細(xì)胞免疫功能等多項(xiàng)免疫指標(biāo)。胸腺脾指數(shù)胸腺脾重量小鼠體重100表1動(dòng)物分組及給藥方法略2.2.2細(xì)胞免疫功能T細(xì)胞增殖試驗(yàn)58常規(guī)制備5

10、106/l脾細(xì)胞懸液備用。在96孔板上加脾細(xì)胞懸液100l/孔，每份設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)3個(gè)空白對(duì)照孔；再加20g/l濃度的nA50l，空白對(duì)照孔加RPI1640培養(yǎng)液50l；用含10NS的RPI1640培養(yǎng)液加至200l，使nA的終濃度為5g/l，置37，52溫箱培養(yǎng)66h；各加5g/l的TT10l，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6h；加DS100l，充分混勻，靜置10in，用酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)570n的D光密度值，以SI6刺激指數(shù)反映細(xì)胞增殖程度結(jié)果見(jiàn)表4：SI試驗(yàn)孔D均值/對(duì)照孔D均值2.2.3體液免疫功能B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)8，9在96孔板上加脾細(xì)胞懸液100l/孔，每份設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)3個(gè)空白對(duì)照孔；再參加10

11、0l濃度為20g/l的LPS作為刺激劑，LPS終濃度為10g/l，空白對(duì)照孔那么加RPI1640培養(yǎng)液100l；然后置于37，52溫箱66h；各加5g/l的TT10l，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6h；加DS100l，充分混勻，靜置10in，測(cè)波長(zhǎng)570n的D值，計(jì)算SI結(jié)果見(jiàn)表4。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2.4紅細(xì)胞免疫功能紅細(xì)胞酵母菌花環(huán)試驗(yàn)10，11常規(guī)制備1.25107/l小鼠紅細(xì)胞懸液和1108/l補(bǔ)體致敏的酵母菌細(xì)胞懸液備用。取兩組小試管，每管加紅細(xì)胞懸液100l，第1組試管加補(bǔ)體致敏的酵母菌懸液100l/管，第2組試管加未致敏的酵母菌懸液100l/管，搖勻，37水浴30in；取出后輕輕搖勻，

12、加0.9%生理鹽水200l/管，混勻；再加0.25戊二醛75l/管，搖勻；分別取1/3量程度涂片，吹干，加甲醛固定，瑞氏染色，油鏡下計(jì)數(shù)。紅細(xì)胞上黏附兩個(gè)或兩個(gè)以上酵母菌者為花環(huán)陽(yáng)性，分別計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，計(jì)算出花環(huán)陽(yáng)性細(xì)胞百分率，第1組為RB3bR花環(huán)，第2組為RBI花環(huán)結(jié)果見(jiàn)表4。2.3板藍(lán)根提取液抗流感病毒的作用1215昆明種小鼠40只，隨機(jī)分4組，10只/組,分組及給藥方法如表2。前3組小鼠乙醚輕度麻醉后，滴鼻感染10倍LD50濃度的F1液50l；正常對(duì)照組那么以0.9生理鹽水50l滴鼻。各組于感染24h前開(kāi)場(chǎng)腹腔注射不同藥物，給藥7d后，禁食、水8h以上，稱重后斷頸處死，解剖取肺臟

13、，測(cè)定小鼠肺指數(shù)。表2動(dòng)物分組及處理方法略2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法上3組或4組數(shù)據(jù)之間采用SPSS11.5軟件的neayANVA的方差分析方法進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。3結(jié)果3.1LD50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。表3F1的LD50測(cè)定略3.2板藍(lán)根提取液對(duì)機(jī)體免疫功能的影響由表4可見(jiàn)，與1組相比，2組的脾指數(shù)略有增加P0.05,3組的脾指數(shù)明顯增加P0.01；2組、3組的T、B細(xì)胞刺激指數(shù)和RB3bR花環(huán)陽(yáng)性率較1組都明顯增高P0.01，而RBI花環(huán)陽(yáng)性率都明顯降低，存在顯著性差異P0.01；并且2組T細(xì)胞刺激指數(shù)比3組明顯增強(qiáng)P0.01，有顯著性差異P0.01。胸腺指數(shù)3組之間無(wú)差異

14、。表4板藍(lán)根提取液對(duì)機(jī)體免疫功能的影響略與正常對(duì)照組比擬，*P0.05，*P0.013.3板藍(lán)根提取液的抗流感病毒作用由表5可見(jiàn)，與4組相比擬，1組、2組、3組的肺指數(shù)顯著降低F=47.020,P0.01。與1組相比，2組的肺指數(shù)較低F=47.020,P0.05；3組的肺指數(shù)明顯低于1組,有顯著性差異F=47.020,P0.01。與4組相比，1、2、3組的體重增加值顯著增高F=25.877,P0.01。與1組相比，2組的體重增加值較高F=25.877,P0.05；3組體重增加值明顯高于1組F=25.877,P0.01,有顯著性差異。表5板藍(lán)根提取液對(duì)肺炎小鼠肺指數(shù)和體重增加的影響略與陰性藥物對(duì)

15、照組，正常對(duì)照組比擬,*P0.05；*P0.014討論?中國(guó)藥典?1985，1990和1995版均只將十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)的枯燥根收載作為正品板藍(lán)根16。板藍(lán)根的提取工藝17有多種，本次實(shí)驗(yàn)采用70%乙醇滲漉法18提取板藍(lán)根液，此法能有效地減少提取過(guò)程中板藍(lán)根靛藍(lán)、靛玉紅、多糖等有效成分的損失，防止加熱時(shí)板藍(lán)根中靛苷的水解和氧化，從而保證了板藍(lán)根提取液中有效成分的含量。脾臟和胸腺是重要的免疫器官，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)在一定范圍內(nèi)可以直接反映機(jī)體的免疫功能的強(qiáng)弱。淋巴細(xì)胞中，T、B細(xì)胞是主要的免疫活性細(xì)胞，nA、LPS分別可以選擇性的刺激T、B細(xì)胞使之增殖，其增殖的才能上下可直接反映機(jī)體免疫功能的

16、強(qiáng)弱。由表4可見(jiàn)，板藍(lán)根提取液可以有效地進(jìn)步小鼠脾指數(shù)，對(duì)小鼠T、B細(xì)胞增殖反響有明顯的增強(qiáng)作用，而且在增強(qiáng)小鼠T細(xì)胞增殖才能方面比胸腺肽注射液作用更明顯，說(shuō)明板藍(lán)根提取液可以明顯進(jìn)步小鼠機(jī)體的免疫功能。F1感染小鼠后，可以引發(fā)小鼠肺部炎性病變，導(dǎo)致小鼠肺組織充血水腫，質(zhì)地變硬，使肺指數(shù)增高。由表5可見(jiàn)，板藍(lán)根提取物可以緩解流感病毒引起的鼠肺炎病癥，降低肺組織實(shí)變程度，具有一定的抗流感病毒的作用，但其作用沒(méi)有陽(yáng)性藥物病毒唑顯著。紅細(xì)胞的免疫功能主要是藉助其膜上的蛋白質(zhì)分子起作用的，紅細(xì)胞膜上3b受體可與補(bǔ)體致敏的酵母菌黏附形成RB3bR花環(huán)，紅細(xì)胞膜上黏附的I中的3b分子可與未致敏的酵母菌黏附

17、形成RBI花環(huán)。RB3bR花環(huán)率和RB花環(huán)率可作為紅細(xì)胞免疫黏附功能的指標(biāo)，假如二項(xiàng)指標(biāo)都低下，判為原發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，為紅細(xì)胞膜3b受體受到破壞和影響所致；假如RB3b受體花環(huán)率降低，而RB-I花環(huán)率增高，為繼發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，是由于循環(huán)免疫復(fù)合物增加，紅細(xì)胞黏附I過(guò)多引起。研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞參與機(jī)體免疫調(diào)控，并有完好的自我調(diào)控系統(tǒng)。因此，紅細(xì)胞的免疫功能可以看作是機(jī)體抗感染免疫的重要因素，是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。由表4可見(jiàn)，板藍(lán)根提取液可以顯著地進(jìn)步小鼠紅細(xì)胞的免疫黏附功能，且其作用同胸腺肽注射液相比擬無(wú)差異。中藥板藍(lán)根作為清熱解毒藥具有悠久的歷史。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究說(shuō)明，中藥板

18、藍(lán)根具有明顯增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用，并且板藍(lán)根提取液對(duì)進(jìn)步小鼠紅細(xì)胞免疫功能作用顯著，同時(shí)中藥板藍(lán)根也具有一定的抗流感病毒功能。因中藥的抑菌、抗毒作用機(jī)制不同于抗生素，不易使細(xì)菌和病毒產(chǎn)生耐藥性，而日益受到關(guān)注。中藥板藍(lán)根作為臨床上一種重要的抗病毒中藥，我們應(yīng)積極發(fā)現(xiàn)其新的藥理作用，開(kāi)拓其新的藥用價(jià)值，并指導(dǎo)臨床合理使用中藥協(xié)同抗生素治療機(jī)體微生物感染，對(duì)減少細(xì)菌和病毒耐藥性的產(chǎn)生也有著積極的現(xiàn)實(shí)意義。參考文獻(xiàn)：1SiegelI,LiuTL,GiEiherN.Thered-elliunesysteJ.Lanet,1981,12(2)：556.2SiegelI,LiuTL,GiEIherN.Re

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