甘草RNA提取方法研究

1、甘草RNA提取要領(lǐng)研究【摘要】目的從甘草差異構(gòu)造中提取高質(zhì)量的RNA，為進(jìn)一步合成雙鏈DNA，構(gòu)建甘草DNA文庫(kù)奠基基矗要領(lǐng)接納幾種常用要領(lǐng)(高鹽溶液法、Lil沉淀法、TAB法和SDS法)提取甘草差異構(gòu)造的RNA，并以1%瓊脂糖凝膠電泳和A260/A280，A260/A230的值作為指標(biāo)。結(jié)果Lil沉淀法對(duì)付甘草差異構(gòu)造中的RNA具有更好的提取結(jié)果，條帶清楚，完備性較好，且A260/A280和A260/A230值均靠近于2.0，根部構(gòu)造產(chǎn)量達(dá)0.220g/g，葉片構(gòu)造產(chǎn)量達(dá)0.275g/g。結(jié)論接納Lil沉淀法提取甘草差異構(gòu)造中的RNA具有更好的結(jié)果，適于從富含多糖的植物構(gòu)造中提取RNA?！娟P(guān)

2、鍵詞】甘草RNA提取多糖Keyrds:RadixGlyyrrhizae；RNAextratin；Aylase甘草(RadixGlyyrrhizae)是一種富含多糖的中藥材，臨床應(yīng)用普及。隨著甘草分子研究的不竭深化，探究快速而有用的RNA提取要領(lǐng)，從甘草差異構(gòu)造中得到高質(zhì)量的RNA成為了研究的關(guān)鍵，也為進(jìn)一步的研究如構(gòu)建DNA文庫(kù)，RT-PR，Nrthern雜交、基因芯片等奠基基矗有關(guān)植物RNA的提取要領(lǐng)已有不少報(bào)道1，但由于植物構(gòu)造具有多樣性，在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中必要探究出順應(yīng)自身研究的植物質(zhì)料的RNA提取要領(lǐng)。本實(shí)行通過(guò)比擬高鹽溶液法、Lil沉淀法等4種常用的植物RNA提取要領(lǐng)，對(duì)甘草差異構(gòu)造的RN

3、A舉行分散研究，從而尋到高效、輕便、實(shí)用于甘草差異構(gòu)造的RNA提取要領(lǐng)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1質(zhì)料一年生甘草的葉片和根部構(gòu)造。用0.1%生理鹽水洗凈，用干凈吸水紙擦干，分成1g/份存于離心管中，于液氮中敏捷凍存，然后轉(zhuǎn)入-70冰箱保存。1.2要領(lǐng)2結(jié)果2.1RNA的產(chǎn)率和純度別離應(yīng)用4種要領(lǐng)對(duì)甘草的葉片和根部構(gòu)造的RNA舉行了提取，產(chǎn)率和純度結(jié)果見(jiàn)表1，此中所列數(shù)據(jù)均為均勻值。表1差異要領(lǐng)提取甘草差異構(gòu)造的產(chǎn)率和純度闡發(fā)略理論上，對(duì)付較純潔的RNA其A260/A280和A260/A230均應(yīng)靠近2.0，A260/A280過(guò)低會(huì)有卵白質(zhì)的污染，A260/A230過(guò)低會(huì)有大分子多糖的污染。由表1中數(shù)據(jù)

4、可以看出，TAB法和SDS法固然可以去除小分子雜質(zhì)和卵白的污染，但是提取的總RNA的含量較低，比擬之下使用高鹽溶液法和Lil沉淀法提取總RNA的產(chǎn)率較高。但是由于甘草構(gòu)造富含多糖，應(yīng)用高鹽溶液沉淀RNA的同時(shí)也將大分子的多糖沉淀下來(lái)，固然產(chǎn)率較高，但是多糖污染嚴(yán)峻，將得到的RNA溶液離心可以或許在管底富集大量的膠狀物，影響下一步操縱。因此，Lil沉淀法具有較好的提取結(jié)果，A260/A280和A260/A230靠近2.0，且產(chǎn)量較高，葉片及根部構(gòu)造均到達(dá)0.2g/g以上。2.2RNA的完備性別離應(yīng)用4種要領(lǐng)對(duì)甘草的兩個(gè)構(gòu)造的RNA舉行了提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取的完備性，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)以

5、下圖1，2。由圖中可以看出，S1和S2的要領(lǐng)提取的總RNA完備性較好，即高鹽溶液法和Lil沉淀法對(duì)付甘草葉片及根部構(gòu)造均具有較好的提取結(jié)果。3討論3.1RNA提取必要留意的題目實(shí)行歷程中要嚴(yán)酷操縱無(wú)酶的環(huán)境，所用試劑都必要滅酶處置懲罰，實(shí)行職員要帶一次性手套和口罩，整個(gè)歷程只管在超凈臺(tái)事情，超凈臺(tái)要提早30in用紫外燈照耀消毒，以淘汰RNase的污染。液氮研磨歷程中要研磨徹底，不然影響細(xì)胞的破裂完全，提出的RNA量少或提不出。3.2防范酚類氧化甘草含有大量酚類化合物，在提取歷程中非常輕易氧化，導(dǎo)致提取歷程中構(gòu)造顏色漸漸加深釀成紅棕色，嚴(yán)峻影響了所提的RNA的質(zhì)量，其重要緣故原由是由于酚類化合物

6、氧化后不成逆地結(jié)合到核酸上并與RNA共沉淀2。為辦理酚類氧化題目，用PVP和-巰基乙醇作為復(fù)原劑3，可以或許進(jìn)步RNA的質(zhì)量，減輕氧化而產(chǎn)生的配景顏色。3.3降服多糖污染甘草富含多糖，尤以根構(gòu)造中多糖含量較多，在完備的細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)在空間上與核酸是分散的，但當(dāng)構(gòu)造被研磨細(xì)胞破裂后，這些物質(zhì)就會(huì)與RNA彼此作用，形成難溶的膠狀物與RNA共沉淀下來(lái)，給提取RNA帶來(lái)了很大的難度。這也是富含多糖植物舉行分子生物學(xué)操縱中常見(jiàn)的困難。本實(shí)行起首在K+離子存在的環(huán)境下，用預(yù)冷的(-20)異丙醇沉淀RNA，進(jìn)一步用高濃度的Lil重沉RNA，到達(dá)撤除多糖的目的。本要領(lǐng)實(shí)用于從含糖量高、黏度大或表達(dá)品貌較低的植物構(gòu)造中提取總RNA，尤其實(shí)用于根類構(gòu)造，為從富含多糖的根類構(gòu)造中提取RNA提供了根據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1FangG,HaarS,GrnetR.AquikandinexpensiveethdfrrevingplysaharidesfrplantgeniDNAJ.Bitehniques,1992(13):52.2ShnEiderbauerAH,SanderannJ,ErnstD.IslatinffuntinalRN