實(shí)驗(yàn)一凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)一凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)第1頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三實(shí)驗(yàn)課要求 試劑用后及時(shí)歸位 及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告 離開時(shí)做好清潔工作第2頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫標(biāo)題日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、操作步驟四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、分析討論第3頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三實(shí)驗(yàn)基本操作一、玻璃儀器的洗滌二、吸量管及微量取樣器的使用三、溶液的混勻四、離心機(jī)的使用第4頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三實(shí)驗(yàn)一 凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)1.掌握凝膠過濾層析法的基本原理；2.掌握

2、凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)的過程。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三二、 實(shí)驗(yàn)原理1. 常用生化實(shí)驗(yàn)技術(shù) 分光光度技術(shù)電泳技術(shù)離心技術(shù)層析技術(shù)第6頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三2. 層析技術(shù)（色譜技術(shù)） 是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力等）建立起來的技術(shù)。第7頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三（1）層析系統(tǒng)的基本組成 固定相 + 流動(dòng)相固體物質(zhì) / 固定于固體物質(zhì)的成分可以流動(dòng)的物質(zhì)：如水和各種溶媒第8頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星

3、期三待分離混合物（A、B）隨流動(dòng)相通過固定相 由于理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí) 受到的阻滯作用小，移動(dòng)速度快分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到將各組分分離的目的第9頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三（2）層析法的分類 按兩相所處狀態(tài)分類 流動(dòng)相液體氣體固定相液體液液層析法氣液層析法固體液 固層析法氣 固層析法第10頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三 按層析原理分類 名稱原理吸附層析法固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附劑

4、表面吸附能力不同而分離分配層析法各組分在流動(dòng)相和固相中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組分與離子交換劑親和力不同而分離親和層析法固定相只能與一種待分離組分專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組分分離凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同第11頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三 按操作形式不同分類 名稱操作形式柱層析法固定相裝于層析柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)分離的層析法，包括一般柱層析法、毛細(xì)管層析法和微粒填充柱層析法平面層析法層析過程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進(jìn)行的層析法，包括紙層析法、薄層層析法和薄膜層析法第12頁，

5、共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三（3）層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 分離效率高 分析速度快 具有極高的靈敏度 應(yīng)用范圍廣適用： 雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析第13頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三3. 凝膠過濾層析法（gel filtration chromatography）（1）原理： 根據(jù)分子大小的差別進(jìn)行分離。每個(gè)凝膠顆粒好象一個(gè)篩子，小分子物質(zhì)可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部，大分子物質(zhì)被排阻在外。 又名分子篩過濾，排阻層析第14頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三第15頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星

6、期三（2）凝膠的特點(diǎn) 屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。 交聯(lián)葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠第16頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三（3）凝膠的選擇葡聚糖凝膠 (商品名: Sephadex，Dextran) 型號: G-10 G-200多孔網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)數(shù)字愈小,交聯(lián)度越大,被篩分物質(zhì)的分子量也愈小吸水能力，每g干膠吸水量的10倍第17頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三Sephadex G-50： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 1500 30000

7、Sephadex G-200： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 5000 80000例：第18頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三B. 瓊脂糖凝膠 ( 商品名: Sepharose , Bio- gel A ) 對實(shí)驗(yàn)條件要求高 ( 溫度, pH ) 40 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝膠工作的上限, 用于大分子物質(zhì)的分離第19頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三C. 聚丙烯酰胺凝膠 商品名: Bio gel P（生物膠P）第20頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三三、實(shí)驗(yàn)操作1. 柱的選擇 直徑： 15 cm 一般長

8、度：直徑 = 10：1 20：1 本實(shí)驗(yàn)玻柱： 直徑0.8 1.5cm 長度 17 20cm第21頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三2. 凝膠選擇、制備 血紅蛋白 溶菌酶 分離 （64500） （11400） 選擇 Sephadex G-50Sephadex G-50： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 1500 30000第22頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三制備： 將干膠顆粒懸浮于5 10倍的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去第23頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三3. 凝膠裝柱柱固定于架子上，

9、垂直放置，關(guān)住出口自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使G-50 開始下沉， 至1 2cm時(shí)，打開出口凝膠逐層上升，至頂部 2-3cm時(shí)，關(guān)閉出口第24頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三注意點(diǎn)： 垂直放置 防止氣泡產(chǎn)生 防止柱的分層第25頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三4. 平衡放置一段時(shí)間，約40分鐘（使凝膠更好的壓實(shí)）注意：防止床面干涸，可適當(dāng)補(bǔ)充蒸餾水第26頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三5. 加樣 加樣前打開出口，使床面的蒸餾水流出，正好露 出床面時(shí)，立即關(guān)閉出口（將干未干） 用滴管將混合樣品(0.6ml，即血紅蛋白和溶菌酶 各0.3ml)緩緩沿柱內(nèi)壁小心加于床表面 打開出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，直到床面重新露出, 立即加入12倍于樣品體積的蒸餾水第27頁，共30頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三6. 洗脫當(dāng)此少量蒸餾水接近流干時(shí)，反復(fù)多次加入蒸 餾水，進(jìn)行洗脫，直到兩帶分開檢查Hb在層析床中色帶位置，待Hb洗脫完后， 用試管分步收集洗脫液 10d/管，每管加