實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定第1頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆召|(zhì)粒提純的原理和方法;掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶.第2頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三預(yù)習(xí)：基因克隆示意圖第3頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三基因克隆操作過(guò)程： 分分離載體和目的基因 切限制酶切載體與目的基因接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 第4頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三基因載體（gene vector）什么是基因載體 把一個(gè)有用的目的DNA片段通過(guò)重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去

2、進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的工具基因載體的作用為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力為目的基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制（或整合）和表達(dá)所需條件第5頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三基因載體應(yīng)具備特點(diǎn)1.具有獨(dú)立復(fù)制能力，在細(xì)胞中能大量繁殖，從而使目的基因大量擴(kuò)增2.作為表達(dá)載體應(yīng)能利用宿主的酶系統(tǒng)，表達(dá)目的基因（表達(dá)能力）3.具有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別和切割位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)）4.細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高（持續(xù)表達(dá)和復(fù)制）5.具有供篩選用的（遺傳標(biāo)記）6.相對(duì)分子量?。ㄒ欢ǖ娜萘浚?第6頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三基因載體類(lèi)型質(zhì)粒(plasmid)粘粒（cosmid）噬

3、菌體(phage)病毒(virus)DNA染色體（BAC/YAC）7第7頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三一.質(zhì)粒DNA的制備1 關(guān)于質(zhì)粒的概念a.什么是質(zhì)粒（plasmid）？b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？c.質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？d.質(zhì)粒的用途有哪些？8第8頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三(1)質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌體內(nèi)、獨(dú)立于染色體的、可以自主復(fù)制的一類(lèi)雙鏈環(huán)狀DNA，在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋(supercoil)形式存在。 9第9頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三 超螺旋DNA(SC DNA)

4、(2)質(zhì)粒的三種構(gòu)型10第10頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三 開(kāi)環(huán)DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。11第11頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三 線狀DNA(linear DNA,L DNA): 如果兩條鏈均斷開(kāi)，即為線狀DNA。電泳時(shí)，三者泳動(dòng)速度大小關(guān)系（？） 12第12頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三(3)質(zhì)粒DNA的一般特性： 質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子,有相對(duì)獨(dú)立性。 它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦

5、予宿主細(xì)胞一些表型。 它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等。13(4)提取質(zhì)粒DNA的目的與意義（？） 基因載體/基因克隆/基因工程第13頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三2 提取質(zhì)粒DNA的常規(guī)方法:2.1 核酸分離純化的總原則： 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整 排除其他分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、 糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、其他DNA、RNA等）第14頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三3.2 分離純化質(zhì)粒DNA 的主要步驟培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增（DNA的擴(kuò)增與選擇）細(xì)菌的收集與裂解 收集高速離心的方法質(zhì)粒DNA的純化 所有純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小

6、及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。第15頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三3. SDS-堿裂解法提取質(zhì)粒DNA3.1 實(shí)驗(yàn)原理：在有EDTA及去污劑（SDS）存在的條件下，用堿處理細(xì)菌，可以使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（染色體DNA、質(zhì)粒DNA、蛋白質(zhì)和RNA等）；處理過(guò)程中，染色體DNA斷裂成不同長(zhǎng)度的雙鏈DNA。16第16頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三強(qiáng)堿環(huán)境（pH12.0-12.6）時(shí)：宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒DNA共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；當(dāng)加入高濃度酸性鹽，pH值恢復(fù)至中性時(shí)：變性的染色體DNA

7、與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物；而質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，能溶解在上清液中，這樣通過(guò)離心可以把染色體DNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去。17第17頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三如果要提高DNA的純度，則可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)。18第18頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三3.2 主要試劑及作用溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisCl組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過(guò)程中的 機(jī)械 剪切作用,防止破壞質(zhì)粒.(保護(hù)作用) EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA

8、酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用） TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）19第19頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成 SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之 變性（裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用） NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用） 20第20頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三溶液III：HAC和KAC組成的高鹽溶液(復(fù)性作用)HAC溶液能中和溶液的堿性，使染色體DNA 變性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。KAC會(huì)與SDS溶解度很低

9、的鹽，并與蛋白質(zhì)形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。第21頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三 實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)加1.4ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm30S 除去上清，再取1.4ml離心30s 除去上清，加入冰的100 l溶液I，顛倒EP管，混勻加入200l溶液II，溫和混勻，冰浴35min加入150l冰溶液III，溫和混勻，冰浴35min，12000rpm5min 轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚和氯仿/異戊醇(1:1)，12000rpm5min 轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積氯仿/異戊醇，12000

10、rpm5min 上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，-20 冰箱中放置20min，120005min 棄上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室溫靜置1015min ， 20 l TE 溶解DNA第22頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三注意事項(xiàng)： 1、加樣槍正確使用； 2、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類(lèi)型（pUC119-U6 ）； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干； 6、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀； 7、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到 皮膚。第23頁(yè)，共36頁(yè)，20

11、22年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三二、限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒 1 關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶 （restriction endonuclease）定義 能在特異位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)）上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNA片段。 主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。 切割不同來(lái)源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀”）。24第24頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身DNA。分類(lèi)、（基因工程技術(shù)中常用型）第25頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三第一個(gè)字母取自產(chǎn)

12、生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第26頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome)切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第27頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第28頁(yè)，共36

13、頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三影響限制酶活性的因素1）“星”活性 酶的特異性改變或特異性降低而呈現(xiàn)的活性。 EcoR：GAATTC EcoR*： AATT2）甲基化 識(shí)別序列中某些堿基甲基化后會(huì)阻礙酶活性。3）底物性狀4）試劑：緩沖系統(tǒng)第29頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三pUC18/19酶切位點(diǎn)的分布示意圖第30頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三2 BamHI 、Hind酶切重組質(zhì)粒及鑒定1 實(shí)驗(yàn)原理： 利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的DNA片段，通過(guò)電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒

14、別目的基因（重組質(zhì)粒DNA）31第31頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三重組質(zhì)粒BamHIHind III雙酶切電泳檢測(cè)5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III第32頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三2 實(shí)驗(yàn)材料: 重組質(zhì)粒; BamHI 、Hind 限制性內(nèi)切酶;反應(yīng)緩沖液;瓊脂糖凝膠電泳所需試劑和設(shè)備。33第33頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)18分，星期三3 實(shí)驗(yàn)步驟:A 建立反應(yīng)體系B 酶切反應(yīng)（溫育1-3h）C 電泳鑒定34第