色譜柱使用和維護(hù)綜述

1、.安裝、啟用和保護(hù)中要點(diǎn)注意事項(xiàng)色譜柱既是液相色譜儀的最核心零件，價(jià)錢相對昂貴，請切記它是高檔儀器中的高檔零件，給它以足夠的尊敬和關(guān)心。如防備激烈的碰撞和震動，只管色譜柱從1米高的實(shí)驗(yàn)臺掉落到水泥地上不至于100%會破壞，但50%的可能破壞你也承受不起。其余不要讓柱床變干，防備在寒冷環(huán)境受凍等。柱頭種類和不銹鋼毛細(xì)管接頭的般配色譜柱是耗費(fèi)品，不是儀器原配的狀況很多。上圖表示柱連結(jié)的6種不相同方式（數(shù)字單位是英寸），假如二者種類不般配將會產(chǎn)生漏液或許死體積過大的現(xiàn)象。接頭比柱頭深度長，不易擰緊而漏液；接頭比柱頭深度短，柱頭內(nèi)留有空隙而產(chǎn)存亡體積，使譜帶展寬和峰拖尾。溶劑的般配變換色譜柱內(nèi)保存溶劑

2、和儀器系統(tǒng)內(nèi)存留溶劑，假如和流動相不般配，使用前需進(jìn)行變換。特別是流動相含緩沖鹽時(shí)，如保存溶劑是純有機(jī)相或有機(jī)比較率高，直接將新柱接入使用，會致使緩沖鹽在柱內(nèi)結(jié)晶析出，最嚴(yán)重會將新柱永遠(yuǎn)不可以逆地破壞。正相柱保存溶劑一般為正己烷，假如要變換成HILIC柱模式使用，因?yàn)檎和楹图状家译娴幕ト苄圆缓?，變換中間需用二氯甲烷或乙酸乙酯過渡。新柱使用前的均衡和老化廠家出廠查驗(yàn)時(shí)一般都已進(jìn)行過均衡，但色譜柱到最后用戶時(shí)間不一，用戶正式測定前最好對色譜柱再次均衡。最好的均衡兼老化一同進(jìn)行的方法是運(yùn)轉(zhuǎn)幾次圓滿的分析程序（包含進(jìn)樣），直到察看到峰形、保存時(shí)間和峰面積堅(jiān)固為止。所謂“老化”是借用了氣相的術(shù)語，目的

3、是達(dá)到分析物在色譜柱以及整個(gè)液相系統(tǒng)流路中的吸附飽和。對某些特定的待測物，如分子量大于1000的，因擴(kuò)散速度慢，老化時(shí)間相應(yīng)要長，可采納大濃度進(jìn)樣或在同一個(gè)洗脫周期內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣多針的方式加速老化。pH使用范圍一般以為硅膠基質(zhì)柱子的pH使用范圍是2-8，這是很大體的。硅膠種類、使用溫度、硅膠表面所鍵合的固定相種類以及緩沖鹽的不相同，對此均有影響。硅膠比孔容小、鍵合密度大的填料pH耐受范圍要大一些，如月旭企業(yè)的UltimateXB-C18色譜柱，采納的是高質(zhì)量硅膠，加上高密度鍵合和雙封尾，使pH耐受范圍最大提升到10。磷酸鹽緩沖鹽浸透力強(qiáng)，有加速硅膠溶解的副作用，它的存在會降低pH使用范圍。有機(jī)雜化

4、硅膠以及硅膠表面涂覆雜化層的硅膠填料，有機(jī)質(zhì)的存在使pH使用范圍能到12以上，月旭企業(yè)的Xtimate系列產(chǎn)品即屬此類。色譜柱保存短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流動相（不含緩沖鹽）保存為佳，以盡量減少下次使用的均衡時(shí)間。一般只建議在長久保存反相柱的時(shí)候用純甲醇或乙腈，一方面純有機(jī)相保存有最大限度減少鍵合相水解的作用，但純甲醇（乙腈）又會將已水解而臨時(shí)吸附在柱內(nèi)的鍵合相洗脫出去，使固定相流失進(jìn)度加速，壽命縮短。純有機(jī)相保存還有易揮發(fā)使柱床變干的弊端，使用80%左右有機(jī)相保存也屬好的選擇，且足以防備長菌。激烈建議在柱身上貼標(biāo)簽注明保存溶劑。CN基柱在有機(jī)極性溶劑中柱床不堅(jiān)固（會致使柱床構(gòu)造坍塌）

5、，適合在水相中低溫保存。低溫保存要保證不發(fā)生固定相凍結(jié)而破壞柱床。離子互換柱和水性SEC柱等適合保存在水溶液中的色譜柱，可加0.05%疊氮化鈉溶液防備長菌。正相柱，不論是短期仍是長久，都介紹保存在所用流動相中二、柱壓問題）以及容量因子k有關(guān)，和柱壓沒關(guān)。但柱壓（P）仍不失為上邊是基本色譜分別方程式，分別度R和柱效（N）、選擇因子（HPLC方法中的最重要參數(shù)之一，因?yàn)橹鶋悍磻?yīng)了色譜柱的內(nèi)部狀況。此刻能承受400bar壓力的HPLC泵很常有，色譜柱如在遠(yuǎn)低于上限的壓力下正常運(yùn)轉(zhuǎn)，不需要我們要點(diǎn)關(guān)注；當(dāng)柱壓高升湊近上限或許柱壓有異樣高升，常常意味著色譜柱出狀況了，需實(shí)時(shí)進(jìn)行維護(hù)和挽救，嚴(yán)重時(shí)色譜柱就

6、已報(bào)廢了。本節(jié)將詳盡察看柱壓問題并提出可行的解決方案。柱壓方程對填補(bǔ)色譜柱，柱壓與黏度()、柱長(L)和流速(F)成正比，與填料粒徑（dp）以及柱管半徑（r）的平方成反比。K0是比浸透性系數(shù)，對填補(bǔ)床，其值約為0.001。經(jīng)過此公式可近似計(jì)算出給定色譜條件下的理論柱壓。只有當(dāng)新柱實(shí)質(zhì)測得的柱壓和理論柱壓相差很大，才能說柱壓存在問題。黏度()取決于流動相溶劑的選擇，為降低柱壓，反相色譜中偏向于選擇低黏度的乙腈，而不是高黏度的異丙醇。自然選擇時(shí)還需考慮溶劑強(qiáng)度、極性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。柱長（L）增添能夠提升分別度（R），流速（F）提升能加速分別，但都會致使柱壓上漲，選擇確立這些運(yùn)

7、轉(zhuǎn)參數(shù)時(shí)，需綜合均衡和折中。填料粒徑對柱壓影響極大，dp降低一倍，柱壓將增添4倍。UHPLC中采納的sub-2m填料，柱壓超出一般HPLC泵的400Bar上限很多。提升柱溫因可降低黏度，相應(yīng)降低柱壓。在梯度洗脫時(shí)，黏度隨流動相構(gòu)成的變化而改變，柱壓也會處在不停變化中。對水/甲醇流動相系統(tǒng)，在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值。內(nèi)徑的影響相同很大，依據(jù)線流速相同柱壓相同的原則，4.6mm內(nèi)徑的色譜柱流速為1ml/min，約相當(dāng)于在2.1mm內(nèi)徑色譜柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制備色譜柱上的5ml/min，計(jì)算公式為v1.0ml/minx（內(nèi)徑r/4.6）2。所以在換不相同內(nèi)徑色譜柱

8、時(shí)，請實(shí)時(shí)調(diào)整流速，免得因高柱壓傷害色譜系統(tǒng)。柱壓降落是儀器系統(tǒng)的連結(jié)有泄露，柱壓不堅(jiān)固一般以為是流路中有氣泡或空穴，和色譜柱有關(guān)的柱壓問題是柱壓上漲。色譜柱構(gòu)造:和柱壓有關(guān)最大的是入口端篩板（inletfrit）以及今后邊1-2cm長度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的空隙被部分擁擠，是柱壓上漲的主要原由。有以下幾類狀況：填料破裂和使用后有填料粉末生成填料破裂一般在裝柱過程中發(fā)生，裝柱壓力過大或所選硅膠機(jī)械強(qiáng)度過低所至，設(shè)定柱壓出廠標(biāo)準(zhǔn)可解決；流動相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并從頭形成填料粉末，擁擠出口端篩板，這種狀況下反沖不起作用，只有改換后篩板，可是翻開承壓

9、的后篩板，對柱床會有不好影響。顆粒物擁擠惹起柱壓上漲和對策可能擁擠入口端篩板（前篩板）和柱頭填料空隙的顆粒物根源有：樣品（制樣時(shí)塵埃和濾紙等帶入）、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動相（溶劑自己含有和配制過程進(jìn)入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運(yùn)轉(zhuǎn)和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變致使）。水緩和沖鹽流動相內(nèi)生長的細(xì)菌，也是顆粒物根源的一種，可擁擠篩板和填料空隙。應(yīng)防備將這種流動相在室溫下久放，可放入冰箱寄存。預(yù)防舉措樣品（甚至標(biāo)準(zhǔn)品）和流動相過濾，既預(yù)防了篩板、柱頭和毛細(xì)管擁擠，又能減少進(jìn)樣閥、活塞桿和截止閥等儀器要點(diǎn)零件的磨損。一般用0.45um孔徑濾膜過濾樣品和流動相，對使用2um以下填料

10、的超高壓柱的，可用0.20um濾膜。濾膜材質(zhì)有重生纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和醋酸纖維等，須依據(jù)和樣品溶劑及分析物的適應(yīng)性謹(jǐn)慎選擇。使用保護(hù)柱或在線過濾器，詳盡安裝地點(diǎn)見以下列圖：在線過濾器內(nèi)裝有可改換的濾片，濾片孔徑一般有2um和0.5um兩種。安裝地點(diǎn)有兩個(gè)可選擇，在進(jìn)樣器和色譜柱之間時(shí)，對樣品和流動相中的顆粒物都有效；在泵和進(jìn)樣器之間，則只對流動相有過濾作用。保護(hù)柱是減小版的色譜柱，內(nèi)含帶填料的可改換的柱芯，安裝在進(jìn)樣閥和色譜柱之間，用于防備色譜柱的化學(xué)污染為主，也有過濾顆粒物的作用。故障除去反沖色譜柱：不連結(jié)檢測器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開始時(shí)反沖壓力可低

11、于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐漸提升沖刷壓力。有時(shí)顆粒物已特別堅(jiān)固嵌入到篩板內(nèi)部，反沖不用然湊效，早反沖、勤反沖相對見效更好。有的廠商為防備擁擠，使用了較大孔徑（2-5um）的前篩板，這種狀況反沖會將填料沖出。換篩板：一般不建議這樣做，因?yàn)閾Q篩板會帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，致使柱效降落?？墒羌偃绶礇_不可以夠解決問題，也只好不得已而為之，要否則就要把色譜柱報(bào)廢了。假如系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍舊高，說明泵出口到色譜柱之間的其余部位，包含進(jìn)樣器、在線過濾器和保護(hù)柱等有擁擠，可逐個(gè)排查。為了減少死體積，毛細(xì)管都做得盡可能的細(xì)，也可能被堵?；瘜W(xué)污染物惹起柱壓上漲和對策根源相同

12、是樣品、流動相和系統(tǒng)，可是根源于樣品的污染最廣泛，特別是對復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前辦理或前辦理不夠的時(shí)候?；瘜W(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其余生物根源的物質(zhì)。像鹽類這樣的保存能力極小的污染物會在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測器一般對此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時(shí)表現(xiàn)為攪亂峰、基線顛簸、斑點(diǎn)甚至負(fù)峰。保存能力中等的污染物，會被慢慢洗優(yōu)秀譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形顛簸和基線遲緩漂移。對強(qiáng)保存的污染物，一般流動相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會逐漸在柱頭積累。有時(shí)，積累在柱頭的污染物可作為新固定相對分析物起作用，惹起保存時(shí)間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭積累到必

13、然程度，假如不采納舉措，會擁擠填料空隙，惹起柱壓上漲。最好的方法是采納適合的溶劑沖刷溶解這些物質(zhì)，同時(shí)又不對填料自己有傷害。如聚合物柱中積累的蛋白類污染物可用pH13-的強(qiáng)堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質(zhì)色譜柱。1）預(yù)防舉措：a制樣時(shí)采納SPE固相萃取等方法，開初將色譜柱殺手類的污染物質(zhì)除去去；b連結(jié)保護(hù)柱。保護(hù)柱是分析柱的延長，在填料種類和粒徑上應(yīng)于分析柱一致，才能最大限度起保護(hù)作用，又不影響色譜性能。一個(gè)設(shè)計(jì)和裝填優(yōu)秀的保護(hù)柱，還可增添分析柱的分別效率。假如因某種原由需在保護(hù)柱頂用不相同的填料，也應(yīng)選擇比其所保護(hù)的分析柱保存能力衰的固定相，這時(shí)的保護(hù)柱圓滿用于截住強(qiáng)保存物質(zhì)，近似于SP

14、E小柱的功能。當(dāng)保護(hù)柱柱芯保護(hù)功能用盡時(shí)，也不可以夠說不可以再沖刷后復(fù)用，但價(jià)錢低不值得去花這個(gè)時(shí)間。c常常對分析柱進(jìn)行沖刷保護(hù)：2)故障除去：已經(jīng)積累很多污染物，用甲醇或乙腈簡單沖刷不見效，介紹使用下邊方法沖刷反相柱100甲醇-100乙晴-75乙晴/25異丙醇-100異丙醇-100二氯甲烷-100正己烷用每種溶劑沖刷最少10個(gè)柱體積，關(guān)于250mm4.6mm的分析柱，適合的沖刷流速是12ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，此后回到本來的流動相系統(tǒng)。對受蛋白類污染的硅膠基質(zhì)反相柱，純有機(jī)溶劑如乙腈或甲醇不可以夠溶解多肽和蛋白質(zhì)。由有機(jī)溶劑、緩沖液和酸,有時(shí)還加上離子對試劑等構(gòu)成的配方?jīng)_

15、刷見效極佳，比方用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液對柱子重復(fù)進(jìn)行梯度洗來重生；Bhadwaj和Day試驗(yàn)了在250mm46mm的柱子中注入100L的三氟乙醇，重奏見效優(yōu)秀。沖刷硅膠、CN和Diol等正相柱建議方法：先用20柱體積50：50正己烷/氯仿沖刷，此后用甲醇、二氯甲烷或許100%醋酸乙酯沖刷。對油脂類物質(zhì)，可用異丙醇沖刷三、峰形問題峰形對稱性的利害對峰面積和分別度有很大的影響，進(jìn)而影響分析結(jié)果的正確性。惹起峰形異樣的要素很多，柱外死體積惹起峰形異樣有個(gè)特色：對先出的峰影響大，對后出峰影響?。恢^塌陷、柱頭和篩板污染會惹起全部的峰形都異樣，而硅醇基次級保存只惹起部分峰拖尾。相塌陷除了惹

16、起保存降落外，也會造成峰拖尾。色譜實(shí)踐中，大多數(shù)的峰形問題都不是色譜柱的問題，儀器參數(shù)設(shè)定、色譜條件和方法正確與否對峰形有很大影響。峰后拖常有的3種拖尾狀況：次級保存惹起峰拖尾的機(jī)理分析：反相色譜中，平常非極性和弱極性的化合物能獲得優(yōu)秀的峰形，而帶有COOH、NH2、NHR、NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較簡單產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅羥基對極性和堿性樣品分子產(chǎn)生次級保存效應(yīng)。反相填料表面有節(jié)余的硅羥基，擁有必然的酸性，其pKa約為4.54.7。依據(jù)電離規(guī)律，流動相的pHpKa2即pH6.7時(shí)，99以上的硅羥基應(yīng)當(dāng)是呈離子狀態(tài)的，即SiO，而pKapH2即pH2.5時(shí)，酸性環(huán)境控制了硅羥基的

17、電離，99以上的硅羥基應(yīng)當(dāng)是呈分子狀態(tài)的，即SiOH，但其極性仍舊存在，即SiOH。SiOH和SiO關(guān)于極性化合物之間的作使勁則是一種極性的靜電作使勁，這種作使勁比范德華力要強(qiáng)得多。同時(shí)，因?yàn)楣枘z表面鍵合了C18長鏈，因?yàn)榭臻g位阻作用，樣品分子中能接觸到節(jié)余硅羥基的機(jī)會不多，只有少部分的分子才能與節(jié)余硅羥基產(chǎn)生強(qiáng)的靜電作用而被推延洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴(yán)重的程度與樣品分子極性大小和節(jié)余硅羥基的多罕有著直接的關(guān)系。上圖是填料表面的表示圖，圓滿硅羥化的硅膠表面硅羥基濃度為8mol/m2，因?yàn)榭臻g位阻的作用，平常與C18硅烷基發(fā)生反應(yīng)的僅達(dá)23.5mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羥基反應(yīng)，如

18、圖中的三甲基氯硅烷，使硅羥基中的氫變?yōu)榱巳谆柰榈囊粋€(gè)惰性基團(tuán)。三甲基硅烷仍是比氫原子大得多，仍是不可以夠?qū)⑷康墓?jié)余硅羥基的活性關(guān)閉掉。相同的樣品在不相同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不相同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度能否高、封尾能否完好，高密鍵合和完好的封尾能顯然減少這種機(jī)會，獲得優(yōu)秀的峰形。Welch企業(yè)Ulimate品牌的XBC18、AQC18和XtimateC18采納的就是高密鍵合和完好的雙峰尾工藝。解決方案：1）先檢查樣品能否過載，因?yàn)闃悠愤^載惹起的峰形后拖不可以夠經(jīng)過改變色譜條件除去。假如發(fā)現(xiàn)過載，需降低進(jìn)樣量（包含進(jìn)樣體積或濃度），進(jìn)樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的

19、測定：2）調(diào)理流動相pH將流動相的pH調(diào)至比弱酸pKa小2以上，比弱堿pKa大2以上，可有效控制易離子化待測物的電離，進(jìn)而獲得優(yōu)秀峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測定：堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64，那么在pH8.64的時(shí)候它是圓滿呈離子態(tài)的，那么pH在2.58.64時(shí)，特別是pH6.78.64時(shí)，此時(shí)甲胺和硅羥基均以離子狀態(tài)NH3和SiO形式存在的，它們之間互相吸引的靜電作用致使后拖，這就是為何很多堿性化合物在pH7.0的條件下簡單產(chǎn)生拖尾的原由。而很多色譜柱生產(chǎn)商也所以以阿米替林（含N(CH3)2，堿性比NH2強(qiáng)）在pH7.0的條件下來談?wù)摵捅容^不相同色譜柱之間的利害，該條件下的阿米替

20、林的峰形越好說明封尾越好。而在pH12.64，大于pKa2以上時(shí)，甲胺圓滿以分子狀態(tài)形式存在，不會惹起拖尾。3）增添緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度：流動相中加入緩沖鹽，加強(qiáng)了流動相的離子強(qiáng)度，在NH3等極性基團(tuán)和硅羥基SiO之間存在著很多離子的攪亂，減少了樣品分子與硅羥基之間互相接觸的機(jī)會，有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥基之間的互相作用，改良峰形。這種適合于堿性較弱（如氨基的N原子與強(qiáng)吸電子基相連），或堿性很強(qiáng)，但在剛性構(gòu)造中，比較難以湊近被C18長鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基，例子如高烏甲素的測定：4）加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉等拖尾的產(chǎn)生是因?yàn)镹H2、NHR、NR2與硅羥基發(fā)生靜電作用惹起的，

21、那么阻截它們之間靜電作用的門路，應(yīng)當(dāng)有兩種，一種是占有硅羥基這個(gè)作用位點(diǎn)，另一種是占有NH2、NHR、NR2這個(gè)作用位點(diǎn)。在流動相中加入三乙胺，能顯然的改良峰形，除去拖尾，其作用是障蔽硅羥基。三乙胺的pKa為11.09，在pH11.0929.09的條件下是以離子狀態(tài)NH(CH2CH3)3的形式存在的，所以pH在2.58.64硅羥基呈SiO離子態(tài)的狀況下，NH(CH2CH3)3簡單與SiO形成相對較強(qiáng)的靜電吸引力。加入三乙胺改良峰形的時(shí)候，有兩點(diǎn)需要注意：1）三乙胺的堿性很強(qiáng)，加入三乙胺后流動相的pH可能超優(yōu)秀譜柱的使用范圍，對色譜柱造成傷害。pH的改變也會致使出峰時(shí)間的顯然變化，可能惹起的其余

22、問題，建議流動相中加入三乙胺后回調(diào)至未加入前的pH值。平常即使pH回調(diào)事后，因?yàn)槿野烦蔀榱斯潭ㄏ嗟囊徊糠?，保存時(shí)間也有較大變化；2）三乙胺在210nm處有比較強(qiáng)的汲取，假如液相方法中檢測波長在210nm以下測準(zhǔn)時(shí)需要謹(jǐn)慎使用。四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離后，也形成了近似NH(CH2CH3)3的構(gòu)造N(CH2CH2CH2CH3)4，這種構(gòu)造也能有效的與SiO產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用，阻截氨基與硅羥基的接觸，改良峰形。并且它還有一個(gè)不相同于三乙胺的顯然特色是，它在低波長范圍的汲取比三乙胺弱。流動相中加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對試劑也能很好的改良峰形，其

23、作用機(jī)理與三乙胺和四丁基硫酸氫銨特別不相同，是經(jīng)過與樣品分子的作用來阻截樣品分子與硅羥基的作用來改良峰形。2峰前延峰前延發(fā)生的概率比較小，下邊是三種前拖峰的表現(xiàn)形式：造成前延峰的原由有多種，我們可挨次逐個(gè)排查：1）樣品能否過載降低進(jìn)樣濃度，看峰形能否有所改良。一般以為峰高在不至于因過載影響峰形。100mAU左右比較適合，檢查是不是用流動相溶解樣品溶解樣品的溶劑（如純甲醇）洗脫能力比流動相強(qiáng)會發(fā)生峰前延。詳盡機(jī)理是：正常的峰形應(yīng)當(dāng)是樣品在色譜柱上均勻的前移的狀況下獲得的，濃度散布在整個(gè)經(jīng)過色譜柱柱床的過程中任何時(shí)候都呈正態(tài)散布。樣品溶液進(jìn)樣后抵達(dá)色譜柱時(shí)間很短，應(yīng)還未被流動相充分稀釋，洗脫能力更

24、強(qiáng)的樣品溶劑的局部存在，將使部分樣品被洗脫的速度加速，致使峰前延。3）增添流動相中緩沖鹽的濃度增添緩沖鹽濃度能夠增大流動相中的離子強(qiáng)度，減少因靜電的作用（有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間）惹起的前延。比方：注射用苦參堿的測定4）流動相中加入適合的四氫呋喃往流動相中加入少許的四氫呋喃有時(shí)能夠改良峰形、增大分別度，很多色譜工作者都知道和使用，但其機(jī)理憂如少人說起。平常所加入的量在5之內(nèi)即可，需要的時(shí)候能夠加入更大的量。例子以下：阿莫西林膠囊的測定色譜柱：UltimateAQC18，5um，4.6250mm；檢測波長：254nm；溫度：室溫28度；流速：1.0ml/mi

25、n；進(jìn)樣量：20ul；5）高升柱溫升溫有助于增添流動相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用惹起的前拖，但溫度不宜太高，溫度太高簡單傷害色譜柱，特別是含有離子對試劑的時(shí)候，最好不要超出40度。3其余峰形問題裂峰：柱頭污染和柱頭塌陷都會造成裂峰，最常有的原由是篩板上顆粒物擁擠樣品進(jìn)入色譜柱不均一，只要反沖色譜柱將顆粒物除去即可解決。四、保存時(shí)間問題分保存時(shí)間重現(xiàn)性和保存時(shí)間單向漂移兩類。保存時(shí)間的重現(xiàn)性在色譜分析中最重要的是分別選擇性，保存時(shí)間的重現(xiàn)性則是可簡單經(jīng)過用峰面積定量取代峰高定量來除去其對分析結(jié)果的影響。溫度、流動相構(gòu)成、pH、離子強(qiáng)度等的微小變化都會惹起保存時(shí)間的改變。保存時(shí)間漂移柱均衡不夠：10

26、-20柱體積流動相均衡是必然的。三乙胺等增添劑加入，均衡時(shí)間需加長。固定相流失：在酸性條件下鍵合相碳鏈水解斷裂流失；2)堿性條件下硅膠基質(zhì)溶解致使在基質(zhì)上鍵合固定相流失；3)pH2-8下，上述兩種要素致使的流失仍會遲緩發(fā)生。多位鍵合比單點(diǎn)鍵合好，長鏈比短鏈鍵合堅(jiān)固，用于封尾的鍵合相易流失；C18鏈的堅(jiān)固性比CN基鏈大三個(gè)數(shù)目級，一個(gè)是3個(gè)月會有顯然流失，一個(gè)是1小時(shí)；用有機(jī)相洗柱子會加速流動相的流失。柱污染：污染物作為固定相的一部分起保存作用，跟著污染程度的逐漸增添，保存時(shí)間發(fā)生趨勢性的變化。流動相構(gòu)成變化:如甲醇等揮發(fā)惹起保存時(shí)間逐漸變大。相塌陷：純水條件下，C18柱會發(fā)生固定相塌陷，惹起保存時(shí)間逐漸變小甚至失掉保存能力。柱與柱之間的重現(xiàn)性同一批填料生產(chǎn)出的不相同柱子