菌體濃度對發(fā)酵的影響

1、一、菌體濃度對發(fā)酵的影響及把握菌體細(xì)胞濃度(cellconcentration)是指單位體積培育液中菌體的含量。無論在科學(xué)研 究上，還是在工業(yè)發(fā)酵把握上，它都是一個重要的參數(shù)。菌濃的大小，在肯定條件下，不僅 究中，需要利用菌濃參數(shù)來算出菌體的比生長速率和產(chǎn)物的比生成速率等有關(guān)動力學(xué)參數(shù)， 以爭辯它們之間的相互關(guān)系，探明其動力學(xué)規(guī)律，所以菌濃仍是一個根本參數(shù)。 需的時間就越長。典型的細(xì)菌、酵母、霉菌和原生動物的倍增時間分別為 45min、90min、3h 和 6h 左右，這說明各類微生物增殖速率的差異。菌體的增長還與養(yǎng)分物質(zhì)和環(huán)境條件有親熱關(guān)系。養(yǎng)分物質(zhì)包括各種碳源和氮源等成分和它們的濃度。依據(jù)

2、Monod 方程式來看， 生長速率取決于基質(zhì)的濃度(Ks 110mgL 之間)，當(dāng)基質(zhì)濃度 c(S)10Ks 時，比生長速率就接近最大值。所以養(yǎng)分物質(zhì)均存在一個上限濃度，在此限度以內(nèi)(如甲醇、苯酚等)對一些關(guān)鍵 酶的(gL)如下：葡萄糖 100、NH4+5、PO43-10。在實(shí)際生產(chǎn)中，常用豐富培育基，促使菌體快速生殖，菌濃增大，引起 (含溶氧)的把握至關(guān)重要。影響 菌體生長的環(huán)境條件有溫度、pH值、滲透壓和水分活度等因素。產(chǎn)率與菌濃成正比關(guān)系，即P=QPmc(X)式中P發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率(產(chǎn)物最大生成速率或生產(chǎn)率)，g(Lh)； QPm產(chǎn)物最大比生成速率，h-1；c(X)菌體濃度，gL。菌濃愈大

3、，產(chǎn)物的產(chǎn)量也愈大，如氨基酸、維生素這類初級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵就是如此。比 最適菌濃即c(X)臨，菌體的生產(chǎn)率最高。但是菌濃過高，則會產(chǎn)生其他的影響，養(yǎng)分物質(zhì) 各種影響。早期酵母發(fā)酵，會消滅代謝途徑轉(zhuǎn)變、酵母生長停滯、產(chǎn)生乙醇的現(xiàn)象；抗生素發(fā)酵中，也受溶氧限制，使產(chǎn)量降低。如圖7-7，為了獲得最高的生產(chǎn)率，需要承受攝氧速 率 OUR OTR 相平衡時的菌體濃度，也就是傳氧速率隨菌濃變化的曲線和攝氧速率隨菌濃變化的曲線的交點(diǎn)所對應(yīng)的菌體濃度，即臨界菌體濃度 c(X)臨。菌體超過此濃度，抗生素的比生成速率和體積產(chǎn)率都會快速下降。7-7 攝氧速率OUR 曲線與傳氧速率OTR 曲線關(guān)系示意圖 (或過稀)的

4、菌體量。然 長，提高菌濃；但補(bǔ)加過多，則會使菌體過分生長，超過 c(X)臨，對產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。在生產(chǎn)上，還可利用菌體代謝產(chǎn)生的CO2 量來把握生產(chǎn)過程的補(bǔ)糖量，以把握菌體的生長和濃度?？傊?，可依據(jù)不同的菌種和產(chǎn)品，承受不同的方法來到達(dá)最適的菌濃?；|(zhì)對發(fā)酵影響及其把握的關(guān)系。所以選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)和把握適當(dāng)?shù)臐舛?，是提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要方法。Monod c(S)1.1EMP RQ 不同。E.coli 以延胡索酸為基質(zhì)，RQ=1.44；以丙酮酸為基質(zhì)，RQ=1.26；以琥珀酸為基質(zhì)，RQ=1.12；以乳酸、葡萄糖為基 質(zhì)，RQ 1.021.00。RQ 值也不一樣。青霉素發(fā)酵的理論呼吸商：菌體

5、生長0.909，菌體維持1，青霉素合成4。從上述狀況看，發(fā) 酵早期，主要是菌生長，RQ1；過渡期菌體維持其生命活動，產(chǎn)物漸漸形成，基質(zhì)葡萄糖 的代謝不僅僅用于菌體生長，RQ 比生長期略有增加。產(chǎn)物形成對RQ 的影響較為明顯，如產(chǎn)物復(fù)原性比基質(zhì)大，RQ 增加；產(chǎn)物氧化性比基質(zhì)大，RQ 就削減。其偏離程度打算于每單位菌體利用基質(zhì)所形成的產(chǎn)物量。實(shí)際生產(chǎn)中測定的RQ 物和除葡萄糖以外的其他碳源RQ 值低于葡萄糖為惟一碳源時RQ RQ 為 0.50.7 之間，且隨葡萄糖與消泡劑參加量之比而波動。RQ 是碳-能源代謝狀況的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的狀況下，碳-能源趨向于完全氧化，RQ 應(yīng)到達(dá)完全

6、氧化的理論值，見表7-1。假設(shè)碳-能源過量及供氧缺乏，可能消滅碳-能源不完全氧化的狀況，從而造成RQ 特別。7-1 一些碳-能源基質(zhì)的理論呼吸商四、CO2 濃度的把握CO2 在發(fā)酵液中的濃度變化不像溶氧那樣，沒有肯定的規(guī)律。它的大小受到很多因素 備規(guī)模大小也有影響，由于 CO2 的溶解度隨壓力增加而增大，大發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的靜壓可達(dá) 0.1MPa 以上，又處在正壓發(fā)酵，致使罐底部壓強(qiáng)可達(dá)0.15MPa。因此CO2 濃度增大，如不提高攪拌轉(zhuǎn)數(shù)，CO2 就不易排出，在罐底形成碳酸，進(jìn)而影響菌體的呼吸和產(chǎn)物的合成。為了把握CO2 的不良影響，必需考慮CO2 在培育液中的溶解度、溫度和通氣狀況。在發(fā)酵

7、過程中，如遇到泡沫上升而引起“逃液”時，承受增加罐壓的方法來消泡。但這樣會增CO2的溶解度，對菌體生長是不利的。CO2 濃度的把握應(yīng)隨它對發(fā)酵的影響而定。假設(shè)CO2 對產(chǎn)物合成有抑制作用，則應(yīng)設(shè)液中的溶解氧，還能調(diào)整 CO2 的溶解度，在發(fā)酵罐中不斷通入空氣，既可保持溶氧在臨界點(diǎn)以上，又可隨廢氣排出所產(chǎn)生的 CO2，使之低于能產(chǎn)生抑制作用的濃度。因而通氣攪拌也是把握CO2 CO2 在發(fā)酵液中的濃度；反之就會減小CO2 3m3 發(fā)酵罐中進(jìn)展四環(huán)素發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵40h 以前，通氣75m3h80rminCO2 的濃度；40h 以后，通氣量和攪拌110m3h 140rminCO2 2530。CO2 形

8、成的碳酸，還可用堿來中和，但不能用CaCO3。罐壓的調(diào)整，也影響CO2 的濃度，對菌體代謝和其他參數(shù)也產(chǎn)生影響。CO2 的產(chǎn)生與補(bǔ)料工藝把握親熱相關(guān)，如在青霉素發(fā)酵中，補(bǔ)糖會增加CO2 的濃度和降低培育液的pH 值。由于補(bǔ)加的糖用于菌體生長、菌體維持和青霉素合成三方面，它們都產(chǎn)生CO2，使CO2 量增加。溶解的CO2 和代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，又使培育液pH 值下降。因此，補(bǔ)糖、CO2、pH 值三者具有相關(guān)性，被用于青霉素補(bǔ)料工藝的把握參數(shù)，其中排氣中CO2 量的變化比pH 值變化更為敏感，所以，承受測定CRR 作為把握補(bǔ)糖速率參數(shù)。第七節(jié)補(bǔ)料的把握補(bǔ)料分批發(fā)酵(fed-batchculture，簡

9、稱FBC)，又稱半連續(xù)培育或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分 連續(xù)發(fā)酵之間的一種過渡培育方式，是一種把握發(fā)酵的好方法，現(xiàn)已廣泛用于發(fā)酵工業(yè)。同傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，F(xiàn)BC 具有以下的優(yōu)點(diǎn)：可以解除底物抑制、產(chǎn)物反響抑制和一例；可作為理論爭辯的手段，為自動把握和最優(yōu)把握供給試驗(yàn)根底。同連續(xù)發(fā)酵相比， FBC 不需要嚴(yán)格的無菌條件，產(chǎn)生菌也不會產(chǎn)生老化和變異等問題，適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣泛。由于FBC 抗生素類、激素藥物類、氨基酸和維生素等十余類幾十種工業(yè)產(chǎn)品中。一、FBC 的作用FBC 的操作比較簡潔，效果也是比較明顯的。但是這種把握方法是建立在什么理論根底 結(jié)果說明，F(xiàn)BC對微生物發(fā)酵有以下幾個根本作用?？?/p>

10、以把握抑制性底物的濃度在很多發(fā)酵過程中，微生物的生長是受到基質(zhì)濃度的影響。要想得到高密度的生物量， 需要投入幾倍的基質(zhì)。按 monod 方程，當(dāng)養(yǎng)分底物濃度增加到肯定量時，生長就顯示飽和型動力學(xué)，再增加底物濃度，就可能產(chǎn)生一種基質(zhì)抑制區(qū)，停滯期延長，菌體比生長速率減 致死(themaldeath)，如乙醇濃度達(dá)10時，就可使酵母細(xì)胞熱致死；有的是因某種或某些 (35)可凝固蛋白；高濃 度基質(zhì)還會轉(zhuǎn)變菌體的生化代謝而影響生長等。 (或丙酸)分別是青霉素、紅霉素的前體物 質(zhì)，濃度過大，就會產(chǎn)生毒性，使抗生素產(chǎn)量削減。有的是受底物溶解度小的限制，達(dá)不到 成轉(zhuǎn)化率不高。質(zhì)或抑制性底物，承受 FBC 方

11、式，就可以把握適當(dāng)?shù)幕|(zhì)濃度，解除其抑制作用，又可得到高濃度的產(chǎn)物。可以解除或減弱分解代謝物的阻遏在微生物合成初級或次級代謝產(chǎn)物中，有些合成酶受到快速利用的碳源或氮源的阻遏， 特別是葡萄糖，它能夠阻抑多種酶或產(chǎn)物的合成，如纖維素酶、赤霉素、青霉素等。這 制基質(zhì)葡萄糖的濃度，就可解除酶或其產(chǎn)物的阻遏，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。如緩慢流加葡萄糖，纖200 0.02905mgL；承受滴加葡萄糖的技術(shù)，可明顯提高青霉素的發(fā)酵單位等。這都是利用發(fā)酵技術(shù)解決分解代謝物阻遏的實(shí)際應(yīng)用。在植物細(xì)胞培育中，也承受該技術(shù)來提高產(chǎn)量。可以使發(fā)酵過程最正確化分批發(fā)酵動力學(xué)的爭辯，說明白各個參數(shù)之間的相互關(guān)系。利用FBC 技術(shù)，就

12、可以使菌種保持在最大生產(chǎn)力的狀態(tài)。隨著 FBC 補(bǔ)料方式的不斷改進(jìn)，為發(fā)酵過程的優(yōu)化和反響簡單的數(shù)學(xué)模型在線方式實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化把握。二、補(bǔ)料的方式及把握補(bǔ)料方式有很多種狀況，有連續(xù)流加、不連續(xù)流加或多周期流加。每次流加又可分為分補(bǔ)料和多組分補(bǔ)料。流加操作把握系統(tǒng)又分為有反響把握和無反響把握兩類不同，又分為直接方法和間接方法。間接方法是以溶氧、pH CO2 分壓及代謝產(chǎn)物濃度等作為把握參 需要詳盡考察分批發(fā)酵的代謝曲線和動力學(xué)特性，獲得各個參數(shù)之間的有意義的相互關(guān)系， 來確定把握參數(shù)。對于通氣發(fā)酵，利用排氣中CO2 含量作為FBC 反響把握參數(shù)是較為常用的間接方法。如把握青霉素生產(chǎn)所用的葡萄糖流加的

13、質(zhì)量平衡法，就是利用CO2 CO2 的釋放率CRR 菌濃。pH 值也已用作糖的流加把握的參數(shù)。 些問題(如耐熱性差)，尚待解決。隨著一系列技術(shù)障礙的抑制，該法將會得到快速普及。反響把握的 FBC，經(jīng)常是依據(jù)個別指標(biāo)來進(jìn)展，在很多狀況下，并不能奏效，尚需進(jìn)展多因子分析。為了改善發(fā)酵培育基的養(yǎng)分條件和去除局部發(fā)酵產(chǎn)物，F(xiàn)BC 還可承受“放料和補(bǔ)料” (withdrawandfill)方法，也就是說，發(fā)酵肯定時間，產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物后，定時放出一局部發(fā) 酵液(可供提煉)，同時補(bǔ)充一局部穎養(yǎng)分液，并重復(fù)進(jìn)展。這樣就可以維持肯定的菌體生高產(chǎn)量的FBC 方法，但要留意染菌等問題。第八節(jié)泡沫對發(fā)酵的影響及其把握

14、一、泡沫的形成及其對發(fā)酵的影響在大多數(shù)微生物發(fā)酵過程中，由于培育基中有蛋白類外表活性劑具有較高的外表張 力 面上的泡沫，氣相所占的比例特別大，與液體有較明顯的界限，如發(fā)酵前期的泡沫；另一種是發(fā)酵液中的泡沫，又稱流態(tài)泡沫(fluidfoam)，分散在發(fā)酵液中，比較穩(wěn)定，與液體之間無 明顯的界限。 方面，與培育基性質(zhì)有關(guān)。蛋白質(zhì)原料如蛋白胨、玉米漿、黃豆粉、酵母粉等是主要的發(fā)泡 條件等因素有關(guān)，其中基質(zhì)中的有機(jī)氮源(如黃豆餅粉等)是起泡的主要因素。當(dāng)發(fā)酵感染雜 菌和噬菌體時，泡沫特別多。 沫乃是保證正常發(fā)酵的根本條件。二、泡沫的消退(如少加或緩加易起泡的原材料)或轉(zhuǎn)變某些物理化學(xué)參數(shù)(如 pH 值

15、、溫度、通氣和攪拌)或者轉(zhuǎn)變發(fā)酵工藝(如承受分次投料)來把握，以削減泡沫形成的時機(jī)。但這些方法的效果有肯定的限度；承受機(jī)械消泡 泡。機(jī)械消泡果不抱負(fù)，僅可作為消泡的關(guān)心方法。消泡劑消泡用，到達(dá)裂開泡沫的目的。如聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)的外表張力僅為 3.310-2Nm，而青霉素發(fā)酵液的外表張力為(6.06.8)10-2Nm。作為生物工業(yè)抱負(fù)的消泡劑，應(yīng)具備以下條件：應(yīng)當(dāng)在氣-液界面上具有足夠大的鋪 害；來源便利，本錢低；應(yīng)當(dāng)對氧傳遞不產(chǎn)生影響；能耐高溫滅菌。常用的消泡劑主要有自然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類及硅酮類等4 大類。 力和對產(chǎn)物合成的影響各不一樣。例如：土霉素發(fā)酵，豆油、

16、玉米油較好，而亞麻油則會產(chǎn)生不良的作用。此類油的質(zhì)量還會影響消泡效果，碘價(表示油分子構(gòu)造中含有不飽和鍵的 多少)或酸價高的油脂，消泡力量差并產(chǎn)生不良的影響。所以，要把握此類油的質(zhì)量，并要 成過氧化物的時機(jī)少，酸價也低，消泡力量強(qiáng)，副作用也小 成過氧化物，對四環(huán)素、卡那霉素的合成不利，故要留意此類油的貯存保管。合物。氧化丙烯與甘油聚合而成的，叫聚氧丙烯甘油(簡稱 GP 型)；氧化丙烯、環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的叫做聚氧乙烯氧丙烯甘油(簡稱 GPE 型)，又稱泡敵。它們的分子構(gòu)造式如下：GP 液中的效果好。其抑泡性能比消泡性能好，適宜用于根底培育基中，以抑制泡沫的產(chǎn)生。如6080 倍。GPE 的親

17、水性好，在發(fā)泡介質(zhì)中易鋪展，消泡力量強(qiáng)，作用又快，而溶解度相應(yīng)也大，所以消泡活性維持時間短，因此，用于黏稠發(fā)酵液的效果比用于淡薄的好。GPE 用于四環(huán)類0.030.035，消泡力量一般相當(dāng)于豆油的 10 20 倍。 的消泡作用。消泡劑多數(shù)是溶解度小、分散性不格外好的高(大)分子化合物，所以在使用時，要考慮 體增效，即用惰性載體(如礦物油、植物油等)使消泡劑溶解分散，到達(dá)增效的目的；消泡劑并用增效，取各種消泡劑的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)展互補(bǔ)，到達(dá)增效，如GP 和GPE l:1 混合使用于土霉素發(fā)酵，結(jié)果比單獨(dú)使用GP 2 倍；乳化消泡劑增效，用乳化劑(或分散劑) 80 制成的乳劑，用于慶大霉素發(fā)酵，效力提高12

18、 倍。擇和實(shí)際使用還有很多問題，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際加以留意和解決。第九節(jié)發(fā)酵終點(diǎn)的推斷或稱生產(chǎn)率、產(chǎn)率是指單位時間內(nèi)單位罐體積發(fā)酵液的產(chǎn)物積存量而言。式中，生產(chǎn)率單位一般為g(Lh)kg(m3h)gL kgm3，發(fā)酵時間單位為h。生產(chǎn)過程不能只單純追求高生產(chǎn)率，而不顧及產(chǎn)品的本錢，必需把二者結(jié)合起來，既要有高產(chǎn)量，又要降低本錢。期，養(yǎng)分耗盡，菌體年輕而進(jìn)入自溶，釋放出體內(nèi)的分解酶會破壞已形成的產(chǎn)物。要確定一個合理的放罐時間，需要考慮以下幾個因素： 一、經(jīng)濟(jì)因素發(fā)酵時間需要考慮經(jīng)濟(jì)因素，也就是，要以最低的成原來獲得最大生產(chǎn)率的時間為最 (或停頓) 而動力消耗、治理費(fèi)用支出、設(shè)備消耗等費(fèi)用仍在增加，因

19、而產(chǎn)物本錢增加。所以，需要從經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點(diǎn)確定一個合理時間。二、產(chǎn)品質(zhì)量因素發(fā)酵時間長短對后續(xù)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量有很大的影響。假設(shè)發(fā)酵時間太短，勢必有過多 的尚未代謝的養(yǎng)分物質(zhì)() 發(fā)酵周期長短對提取工序的影響。三、特別因素在個別特別發(fā)酵狀況下，還要考慮個別因素。對老品種的發(fā)酵來說，放罐時間都已把握，在正常狀況下，可依據(jù)作業(yè)打算，按時放罐。但在特別狀況下，如染菌、代謝特別(糖 耗緩慢等)，就應(yīng)依據(jù)不同狀況，進(jìn)展適當(dāng)處理。為了能夠得到盡量多的產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)時采 取措施(如轉(zhuǎn)變溫度或補(bǔ)充養(yǎng)分等)，并適當(dāng)提前或拖后放罐時間。合理的放罐時間是由試驗(yàn)來確定的罐的生產(chǎn)率和產(chǎn)品本錢，承受生產(chǎn)率高而本錢又低的時間，作為

20、放罐時間。 般對發(fā)酵和原材料本錢占整個生產(chǎn)本錢主要局部的發(fā)酵產(chǎn)品(kg 產(chǎn)物kg 基質(zhì))和發(fā)酵系數(shù)kg 產(chǎn)物(罐容m3h) 時，還應(yīng)考慮總生產(chǎn)率(放罐時產(chǎn)物濃度除以總發(fā)酵生產(chǎn)時間)。這里總發(fā)酵生產(chǎn)時間包括發(fā) 每噸冷卻水所得到的產(chǎn)物產(chǎn)量下跌。另外，放罐時間對下游工序有很大影響。放罐過早，會殘留過多的養(yǎng)分(如糖、脂肪、 可溶性蛋白)對提取不利( 會延長過濾時間，還會使產(chǎn)物產(chǎn)量降低(有些抗生素單位下跌)，擾亂提取作業(yè)打算。放罐臨 近時，加糖、補(bǔ)料或消泡劑都要慎重，因殘留物對提取有影響。補(bǔ)料可依據(jù)糖耗速率計(jì)算到 態(tài)、pH 值、培育液的外觀、黏度等確定。染菌罐一般過濾速度較慢。放罐時間可依據(jù)作業(yè)打算進(jìn)展

21、，但在特別發(fā)酵時，就應(yīng)當(dāng)機(jī)立斷，以免倒罐。品種發(fā)酵，更需摸索合理的放罐時因素統(tǒng)籌考慮。第十節(jié)發(fā)酵過程檢測與自控發(fā)酵過程的根本任務(wù)是要對菌株所具有的內(nèi)在生產(chǎn)力量實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，從而以較低的 業(yè)中的應(yīng)用目前仍受到很大的局限，需要各學(xué)科的專家共同作出進(jìn)一步的努力。發(fā)酵過程檢測是為了取得所給定發(fā)酵過程及其菌株的生理生化特征數(shù)據(jù)打算種子罐移種和發(fā)酵罐放罐的時間；對不行測變量進(jìn)展間接估量；對過程變量按給定值進(jìn)展手動把握或自動把握；通過過程模型實(shí)施計(jì)算機(jī)把握；收集生疏和進(jìn)展過程(包括建立數(shù)學(xué)模型)所必需的數(shù)據(jù)。檢測的方法有物理測量(如溫度、壓力、體積、流量等)，物理化學(xué)測量(pH 值、溶O2、溶 CO2、氧化

22、復(fù)原電位、氣相成分等)，化學(xué)測量(基質(zhì)、前體、產(chǎn)物等的濃度)，以及生物學(xué)和生物化學(xué)測量()。這些測量可供給反映環(huán)境變 7-2中。7-2 發(fā)酵過程變量檢測系統(tǒng)一、發(fā)酵過程對傳感器的特別要求為了適應(yīng)自控的需要，發(fā)酵過程變量變化的信息，應(yīng)盡可能通過安裝在發(fā)酵罐內(nèi)的傳算機(jī)處理。 求，諸如：牢靠性、準(zhǔn)確性、準(zhǔn)確度、響應(yīng)時間、區(qū)分力量、靈敏度、測量范圍、特異性、 感器來說都沒有問題，但有的如pH 值和溶氧傳感器在滅菌后需要重校準(zhǔn)。不能耐受蒸汽滅菌的傳感器可在罐外用其他方法滅菌后無菌裝入O”形環(huán)密封、套管隔斷等。還 有如聚 四氟乙烯或拋光的不銹鋼，與發(fā)酵液的接觸面不存在簡潔包藏污垢的死角，便于清洗的形狀和構(gòu)造等來抑制。二、發(fā)酵過程的主要在線傳感器在線傳感器的缺乏，始終是制約發(fā)酵過程自控的主要因素。經(jīng)過各學(xué)科學(xué)者的共同努力，近十多年來在這方面已有很大的進(jìn)展。現(xiàn)選擇一些常見的傳感器作一簡介。