激光共聚焦煙草

1、實(shí)_業(yè)姓狄晨學(xué)日期地點(diǎn)農(nóng)生B-課程稱細(xì)胞生實(shí)_業(yè)姓狄晨學(xué)日期地點(diǎn)農(nóng)生B-課程稱細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師安千成績(jī)激光掃共聚焦顯微鏡工作原理及用稻瘟菌 實(shí)驗(yàn)類(lèi)型驗(yàn)組學(xué)生姓魯楠一1實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟊靥?1了解綠色熒光蛋白green fluorescent proteinGFPV子用于監(jiān)測(cè)靶因的裝線31掌握用激光掃共聚焦顯微鏡成像的要素并檢測(cè) GFP 標(biāo)記蛋白在真菌細(xì)胞內(nèi)的定 二1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理必填11熒光熒光是物質(zhì)V子中的電子吸收了光的能由P能態(tài)躍遷到高能態(tài)再回到的光2激能發(fā)射熒光的物質(zhì)被稱熒光物質(zhì)2熒光物質(zhì)激回到態(tài)過(guò)程中除發(fā)射熒光外能以w它形式如熱能和磷能即有能損失也即光物質(zhì)吸收高能短光而發(fā)射P能長(zhǎng)熒

2、光2而對(duì)于一些非熒光物質(zhì)以通過(guò)或稱熒光探針結(jié)合或反而化熒光物質(zhì)個(gè)過(guò)程被稱熒21熒光顯微鏡工作原理光源發(fā)的光線通過(guò)激發(fā)濾鏡ion filterV濾定長(zhǎng)范圍的激發(fā)光2激發(fā)光被二向色鏡或稱V色鏡dichroicirror改方向通過(guò)物鏡照射品激發(fā)品發(fā)射長(zhǎng)熒光2來(lái)自品的熒光通過(guò)V色鏡而來(lái)自rblockfilter,阻斷短光進(jìn)入目鏡231激光掃共聚焦顯微鏡的工作原理LSCM 是在熒光顯微鏡礎(chǔ)P用激光激發(fā)點(diǎn)掃和用共聚焦裝置焦點(diǎn)熒光信排除非焦點(diǎn)的熒光信從而實(shí)光即LSM是集熒光顯微高性能算機(jī)和數(shù)_圖像處理體的高精度顯微成像系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡成像原理在光源和檢測(cè)器前各有一個(gè)針孔 pinhole或稱孔光欄V別稱照

3、明針孔illmintionpinhol和檢測(cè)針孔detetionpinhol 2由激光光物質(zhì)激而發(fā)射的熒光經(jīng)物鏡和V光器beamspliter通過(guò)檢測(cè)針孔到達(dá)檢測(cè)器光電倍增管 PMT2通過(guò)照明針孔和檢測(cè)針孔的光線經(jīng)一系列的鏡都聚焦于焦點(diǎn)2焦點(diǎn)既PMT檢測(cè)到的由激光點(diǎn)掃焦面而發(fā)射的熒光信被算通過(guò)顯微鏡P裝置的微步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)載物在垂直方向z軸移動(dòng)x有穿性的激光能對(duì)厚品表面Q一定深度的區(qū)域進(jìn)行連續(xù)光學(xué)W片進(jìn)而由算機(jī)數(shù)_圖xy二維圖像建品的O維結(jié)構(gòu)2V子用于檢測(cè)靶因表達(dá)和靶蛋白最大熒光吸收/395 nm475 nm 有一個(gè)肩峰熒光發(fā)射峰508 nm2GFP GFP O需要外物和輔因子GFP 生色團(tuán)的形

4、成是自催化的, 檢測(cè)FP Ser6rl7 l酸殘的碼序列產(chǎn)生了O的改了吸收和發(fā)射光譜從藍(lán)到黃P 突體如(enhaced) FP , 8 m , 8 2P蛋白作內(nèi)V子被廣泛用于監(jiān)測(cè)靶內(nèi)的V布和態(tài)2本實(shí)驗(yàn)中所GFP 生色團(tuán)O點(diǎn)及空間P相鄰的l酸通過(guò)突碼酸序列的堿被改了對(duì)碼 GFP 的酸序列做了w他修改以適合 GFP 因在真菌細(xì)胞或植物O1實(shí)驗(yàn)材料P試劑必填組成型表達(dá)連有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定O序列的 GFP的因煙草 16c無(wú)菌水211養(yǎng)煙草老師完成1開(kāi)機(jī)LASAF LeicaApplication Suite Advanced Fluorescence 程序路設(shè)置激發(fā)光488nm所檢測(cè)的發(fā)射光500550nm或

5、更500530nm23用倒置熒光顯微鏡的P倍I3 濾塊cube激發(fā)長(zhǎng) 450490 nmV510 nm發(fā)射長(zhǎng)大于 515 nm預(yù)覽調(diào)焦找到有發(fā)綠色熒光區(qū)域24往數(shù)1.4 63 倍油物鏡鏡頭P滴少無(wú)熒光浸油用油鏡找到所要觀察的區(qū)域5點(diǎn)Live 用標(biāo)準(zhǔn)掃頻400 Hz1像素V辨512512dpi 和針孔徑度1 Airy 預(yù)掃調(diào)節(jié)焦面1激光強(qiáng)度1PMT 電壓增gain 值和offset 值在預(yù)覽到適度的所觀測(cè)的圖像選用像素V辨率 10241024 dpi1P頻 200 Hz 和線均 line average 3點(diǎn)Capture 掃成像26將獲得的清晰圖像以 TIFF 格式輸儲(chǔ)七1實(shí)驗(yàn)結(jié)果七1實(shí)驗(yàn)結(jié)果PV注釋ERendoplasmicreticulum 內(nèi)質(zhì)注釋ERendoplasmicreticulum 內(nèi)質(zhì)Nnuclear 細(xì)胞CVcentral箭頭所指細(xì)胞生型煙草中未檢熒光標(biāo)記而在突體中GFP P內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定O序列形成融合因液所以在煙草突體中以看到被 GFP 標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)以證明 GFP