梁光義 抗乙肝一類新藥y101的研究

1、抗乙肝一類新藥Y101的研究 梁光義 劉昌孝 黃正明 貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室 天津藥物研究院 中國人民解放軍第302醫(yī)院 貴州百靈制藥 概述： 乙型肝炎的危害是世界性的問題，特別是亞非國家病毒攜帶人群比例極高，中國約占總人口的8%，據(jù)國家衛(wèi)生部2009最新調(diào)查公布，在中國，乙肝病毒攜帶者已高達億,其中乙肝患者已達到2200萬，每年發(fā)生癌變的患者超過300萬，而死于肝癌患者更超過160萬。 現(xiàn)有抗肝炎病毒藥物的現(xiàn)狀 盡管用于治療乙肝的藥物種類眾多，但至今尚沒有一種理想的治療藥物。 核苷類藥物拉米夫定、恩替卡韋、阿德福韋酯等藥物容易導致病毒變異和停藥后反跳。 干擾素對乙肝的治愈率低

2、，而復發(fā)率較高，且價格昂貴（每一療程約需24萬元），臨床難以廣泛使用。 中藥有效成分甘草次酸、齊墩果酸、水飛薊賓等療效不顯著。 本研究組從1993年起，對貴州省的治療肝炎的民族藥進行了較為系統(tǒng)的篩選，選擇了治療肝炎用的小花清風藤、尖葉清風藤、四川清風藤、冊亨清風藤、葉下珠、姜黃、甘草和梔子等10多種中藥民族藥進行了抗乙肝活性成分的廣泛研究。 Dichondra repens Forst. 馬蹄金 苗藥馬蹄金為旋花科植物，歸肝經(jīng)，用于治療黃疸、水腫，（貴州省中藥材、民族藥材質量標準2003版）民間用于治療肝炎，是苗藥金馬肝泰膠囊的君藥。 1999年國家自然科學基金 “民族藥馬蹄金生物活性成分的研

3、究”，（批準號：39960081）。 馬蹄金素（Repensine）dipeptide derivatives with anti-HBV activity 發(fā)現(xiàn)在苗藥馬蹄金中的馬蹄金素，有抗乙肝病毒作用，且具有二肽結構?？挂腋位钚裕▏倚滤幒Y選中心）Concentration (mol/mL)Inhibiting HBV in 2.2.15 cell lineHBsAgHBeAg馬蹄金素0.149.0 %20.0 %Aciclovir 0.452.9 %44.2 %比阿西絡韋作用強，無細胞毒作用，新結構類型2002年申請專利。 馬蹄金素專利 (ZL 02 160309.X) ，2005 馬蹄

4、金素的深入研究：在獨特的二肽結構基礎上合成一系列衍生物。 100 衍生物11馬蹄金素衍生物的合成路線：12序號取代基R1R2R3R41HHHCOONa2HHHCOOCH33HH4-OHCOOCH344-OHHHCH2OH5H3-CH3HCH2OH64-NO2HHCH2OH7H2-ClHCH2OH8H3-CH3HCOOCH39H2-ClHCOOCH310H2-Cl4-OHCOOCH3部分已合成的馬蹄金素衍生物結構：13序號取代基R1R2R3R411HH4-O-EtCOOCH3124-NHAcHHCH2OAc134-NHAcHHCH2OH144-NO2HHCOONa154-NO2HHCOOCH31

5、6HH4-O(CH2)3CH3COONa174-NHAc4-CH34-OCOCH3COOCH318HH4-NHAcCH2OH194-OCH2COONaHHCH2OH204-NHCOCH2CH2COONa4-ClHCH2OH部分已合成的馬蹄金素衍生物結構馬蹄金素衍生物體外抗乙肝病毒篩選試驗細胞培養(yǎng)2.2.15細胞消化,吹打 1:3傳代細胞計數(shù)長成單層后實驗馬蹄金素衍生物體外抗乙肝病毒篩選部分結果compoundTC50(g/ml)抑制DNA復制IC50(g/ml)SI117.81 0.6328.272450.67 51.788.70377.04 25.193.06428.74 1.0228.29

6、553.42 1.1645.936587.06 103.255.697198.46 48.504.098346.68 105.883.279240.38 52.004.6210396.81 95.984.13compoundTC50(g/ml)抑制DNA復制IC50(g/ml)SI1189.23 24.203.691243.11 0.8252.571353.42 4.9610.7814451.20 59.487.5915358.02 53.126.7416388.03 13.1229.5717388.03 6.6258.6118577.35 87.506.6019160.25 13.5111.

7、8620257.31 54.284.74馬蹄金素衍生物體外抗乙肝病毒篩選部分結果compoundTC50(g/ml)抑制DNA復制IC50(g/ml)SI21574.76 68.708.3722388.03 4.5685.0923129.34 1.4390.452480.13 2.3933.532514.37 0.3442.262686.23 11.677.3927388.03 2.41161.012886.23 7.2811.842964.15 7.049.113078.52 6.9811.25馬蹄金素衍生物抗乙肝病毒體外篩選部分結果化合物TC50(g/ml)抑制HBsAg抑制HBeAg抑制

8、DNA復制IC50(g/ml)SIIC50(g/ml)SIIC50(g/ml)SI3150025.1919.85-32.9615.232*388.03 33.51 11.5813.5128.722.4158.603386.23 -9.598.9934388.03 150.202.58-27.2814.22351000-252.603.963686.23 -1.4459.9737130.56 -10.5612.363843.11 -1.8123.8239388.03 -25.0015.523TC786.00 -18.9041.59馬蹄金素衍生物抗乙肝病毒體外篩選部分結果*32 Y10119Y10

9、1臨床前研究路線：馬蹄金素衍生物Y101獲得臨床試驗批件藥學研究藥效學研究安全性評價藥代動力學研究綜合評價研究技術路線：20 1、候選藥物Y101的藥學、質量標準及穩(wěn)定性初步研究結果： 比較了8條合成路線，確定并優(yōu)化了Y101的化學合成工藝：8 kg左右（含量 99%，單一雜質含量 0.2%），Y101全合成原料及試劑價廉易得、工藝簡單，反應條件溫和、總產(chǎn)率較高，適合大規(guī)模制備。 Y101的合成工藝優(yōu)化結果（總收率：36%） 化學藥物雜質研究的技術指導原則 指導原則編號【 H】G P H 3 - 1最大日劑量報告限度鑒定限度質控限度2g0.05%0.10%或 1.0mg （取最小值）0.15%

10、或 1.0mg （取最小值）2g0.03%0.05%0.05%檢查項目/批號200912012009122920100104-220100106-3備注熔點（）177.4-178.1177.3-178.3176.7-177.1177.3-178.2比旋度-63.18-62.48-62.52-63.79干燥失重0.05%0.22%0.35%0.42%0.5%有關物質0.69%0.53%0.33%0.25%單個有關物質20 20 20 20 2045 i) 體內(nèi)代謝穩(wěn)定性預試驗：目前已經(jīng)建立了通過LC/MS/MS測定Y101原型藥物和代謝產(chǎn)物的分析方法；初步發(fā)現(xiàn)了6個主要體內(nèi)代謝產(chǎn)物；初步測定了Y

11、101的體內(nèi)代謝半衰期為3個小時左右。Y101的體內(nèi)代謝產(chǎn)物初步研究結果Y101研究小結： Y101體內(nèi)外試驗表明，Y101對HBsAg、 HBeAg 、DHBV-DNA均有有明顯的抑制作用，無明顯反跳，能有效的清除細胞內(nèi)cccDNA，并且具有保肝作用，對人P450同工酶沒有抑制作用，絕對生物利用度達到64.10%。半衰期3小時。 目前正在進行Y101的長毒等試驗。 Y101具有較好的抗乙型肝炎病毒藥物開發(fā)應用前景。 馬蹄金素計算機藥物分子輔助設計實驗值與預測值相關圖（training set）以COOCH3類為例觀察取代基對化合物活性的影響：H-bond donor(-0.00250.002

12、5)Positive: Light blue; negative: Light orangeHydrophobic/non-polar(-0.0150.015)Positive: Green; negative: PurpleCombination effect(-0.0150.015)Positive: blue; negative: redCOMFA結果，其中左圖為R1與R2部分，右圖為R3部分。Green(+) - Yellow(-) Steric (立體效應)Blue(+) - Red(-) Electrostatic（靜電效應）HBV聚合酶蛋白模型在Swiss model服務器上進行

13、三維構型預測，所得HBV的活性區(qū)域的三維結構如下圖所示。 對于COOCH3類化合物來說，Electron withdraw: R1的3位、R2的4位和R3的4位增加吸電子基團有利于活性提高，而R1的4位增加增加吸電子基團則不利于活性的提高。Hbond donor: R3的4位在連接的第一個原子上連有氫鍵供體的O,N等不利于活性提高，但R2的4位和R3的4位如果在連接的第二個原子上連有氫鍵供體則有利于活性的提高。Hydrophobicity: R1的4位、R2的2、3位增加疏水性有利于活性的提高。結合構效關系的結果，進行馬蹄金素衍生物合成 合成500多個馬蹄金素衍生物，尋找更好的抗HBV的目標化

14、合物。 Y101專利與資助 1、N-(N-苯甲酰基-苯丙氨?；?-苯丙氨酸二肽衍生物及其制備方法和用途, 專利號：200610201016.4 2、苯丙氨醇類化合物作為制備治療乙肝藥品的應用及其制備方法。專利號：02160309.X 3、PHENYLALANINE DIPEPTIDE DERIVATIVES, COMPOSITION AND USE THEREOF , USP 12/056.506 論文：Synthesis and anti-hepatitis B virus activities of Matijing-Su derivatives ，Bioorganic & Medicin

15、al Chemistry，2009，17：3118-3125Article title: Synthesis and biological evaluation of Matijing-Su derivatives as potent anti-HBV agents，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2009，11,5352-5360 另有4篇中文核心期刊論文發(fā)表。資助：1、科技部國際合作項目，抗乙型病毒性肝炎新藥Y101的研究開發(fā)，項目編號：2008DFB30110 2、國家十一五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項，以馬蹄金素為先導化合物的新型抗乙型肝炎病毒候選藥物研究，項目編號：2009ZX09103-0793、國家十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項，治療乙型肝炎一類新藥Y101的臨床前研究，2011ZX09102-009-02 4、國家自然科學基金：民族藥馬蹄金生物活性成分的研究, 1999年批準號：399600815、國家自然科學基金：馬蹄金素衍生物的設計、合成及其抗乙肝病毒活性的研究，2007年，批準號：30760292 6、貴州省科技廳重點項目YGT及其衍生物的合成及抗乙肝病毒的研究，黔基合計字(2002)3012號7、貴州省中藥現(xiàn)代化項目XGL衍生物的合成及其抗乙肝病毒的研究，黔科合農(nóng)字200650018、貴陽市科技局重點項目，國家一