幾種蛋白質含量測定方法的比較

1、I=Jl=lI=Jl=l【摘要】 ： 蛋白質含量測定方法，是生物化學 【摘要】 ： 研究中最常用、最基本的分析之一。目前 常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法（Biuret）、紫外吸收法、考馬斯亮藍法（Bradford）, Folin一酚試劑法（Lowry）杜馬斯燃燒法。其中 Bradford 法靈敏度頗 高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比 Biuret 法靈敏 100 倍以上。凱氏定氮法雖 然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測 定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。過去Folin酚試劑法法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難 （現(xiàn)在已可以在本公司訂購），近年來逐 漸被考馬斯亮蘭法所取

2、代。測定農產品中 全氮的凱氏定氮法在許多國家已被杜馬 斯然燒定氮法所代替，杜馬斯燃燒法是基 于在高溫下（大約900 C）,通過控制進 氧量、氧化消解樣品的原理而進行氮測定 的。這6 種方法并不能在任何條件下適用 于任何形式的蛋白質，每種方法都有其優(yōu)缺點，在選擇方法時應考慮：實驗對測 定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質的 性質； 溶液中存在的干擾物質； 測定所要花費的時間【關鍵詞】:凱氏定氮法 雙縮脲法 紫外吸收法 考馬斯亮藍法Folin酚試劑法 杜馬斯燃燒法一 、凱氏定氮法原理凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、 蒸餾、吸收和滴定 4 個過程。其原理是樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑 作用下共

3、熱消化，含氮有機物分解產生氨, 氨又與硫酸作用,變成硫酸銨。然后加堿蒸 餾放出氨, 氨用過量的硼酸溶液吸收,再 用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為 蛋白質含量。特點凱氏定氮法是目前分析有機化合物含 氮量常用的方法，是測定試樣中總有機氮 最準確和最簡單的方法之一，被國際國內作為法定的標準檢驗方法。凱氏定氮法樣 品的最佳消化條件為硫酸銅 2.50 g, 硫酸 鉀0.10 g,濃硫酸mL；硫酸銅的用量為影 響消化時間的主要因素,硫酸鉀和濃硫酸 用量為第二和第三主要因素；用此最佳條 件做實驗，消化時間僅為12 min ；與其他 硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對比, 該法所需消化時間最短,試劑用量減少,

4、可 降低實驗成本,也降低了對環(huán)境的污染。凱氏定氮法適用范圍廣泛，測定結果準確,重現(xiàn)性好，但操作復雜費時,試劑消 耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的 消化裝置, 可同時測定幾份樣品，節(jié)省時 間,提高了工作效率，適用于批量蛋白質的 測定,具有準確、快速、簡便、低耗、穩(wěn)定 的優(yōu)點。二、雙縮脲法(Biuret )原理雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子 脲經180匕左右加熱，放出1個分子氨后 得到的產物。在強堿性溶液中,雙縮脲與 CuSO4 形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的 肽鍵,或能夠以 1 個中間碳原子相連的肽 鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合 物顏

5、色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與 來測定蛋白質含量。特點雙縮脲法中樣品的取用量對測定結果I=Jl=l雙縮脲法中樣品的取用量對測定結果I=Jl=l的準確性有顯著影響, 采用 0.5 g 樣品,40 mL 雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測精 度。雙縮脲法對不同的蛋白質產生顏色的III深淺相近,不受溫度的影響。可快速測定蛋 白質含量，試劑單一,方法簡便，但靈敏度 差，測定范圍為120 mg蛋白質。適用 于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白 質測定，常用于谷物蛋白質含量測定。III三 、紫外吸收法原理蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質具 有吸收紫外光的性質,吸收峰在

6、 280 nm處,其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成 正比。此外,蛋白質溶液在 238 nm 的光吸 收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下, 蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的 正比關系,可以進行蛋白質含量的測定。特點最常用的紫外吸收法是 280 nm 的光吸 收法，含有核酸的蛋白質溶液使用 280 和 260 nm 的吸收差法較好。蛋白質的稀溶 液采用 215 與 225 nm 的吸收差法。紫外 吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品， 低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收 使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連 續(xù)檢測,因為此時只需測定蛋白質濃度的 變化,而不需知道其絕對值。缺點是測定蛋白質含

7、量的準確度較l=Jl=ll=Jl=l差,干擾物質較多,在用標準曲線法測定蛋 白質含量時,對那些與標準蛋白質中酪氨 酸和色氨酸含量差異大的蛋白質有一定 的誤差,故該法適于用測定與標準蛋白質 氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有l(wèi)=Jl=ll=Jl=l嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質, 會出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強 吸收，但通過校正可以消除。但是因為不 同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同 的,雖然經過校正,測定的結果還是存在一 定的誤差。此外,進行紫外吸收法測定時, 由于蛋白質吸收高峰常因 pH 的改變而有 變化,因此要注意溶液的 pH 值,測定樣品 時的 pH 要與測定標準曲線的 pH

8、 相一 致。四 、考馬斯亮藍法( Bradford)原理Bradford 法是根據(jù)蛋白質與染料相結 合的原理設計的?？捡R斯亮藍是一種有機 染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液 中與蛋白質的堿性氨基酸( 特別是精氨 酸)和芳香族氨基酸殘基結合后變?yōu)樗{ 色，其最大吸收波長從 465 nm 變?yōu)?595 nm,蛋白質在11 000 pg范圍內，蛋白 質色素結合物在 595 nm 波長下的吸光度與蛋白質含量成正比,故可用于蛋白質 的定量測定。特點考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合反應 十分迅速而穩(wěn)定,2 min 左右即達到平衡, 其結合物室溫下1 h內保持穩(wěn)定，且在5 20 min 之間,顏色的穩(wěn)定

9、性最好。該法方 法簡便,易于操作,所用試劑較少,顯色劑易 于配制。干擾物質少,如糖、緩沖液、還原 劑和絡合劑等均不影響顯色。此法的缺點 是由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族 氨基酸的含量不同, 因此Bradford 法用于不同蛋白質測定時用Y-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面 的偏差。標準曲線也有輕微的非線性,因而 不能用 Beer 定律進行計算,而只能用標準 曲線來測定未知蛋白質的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋l(fā)=J|=|用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋l(fā)=J|=|l=J|=|白質的測定。原理Lowry 法蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方 法

10、，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以在本公司訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試 而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯 色反應產生深蘭色的原因是：在堿性條件 下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合 物。Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸I三I三|=|劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基 還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合 物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白 的量成正比。特點Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物 化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的 優(yōu)點是靈

11、敏度高，比雙縮脲法靈敏得多， 缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反 應發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 Lowry 反應。而且對后者的影響還要大得多。酚 類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨 酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較 低的尿素（%），硫酸納（1%），硝酸納 （1%），三氯乙酸（%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品 酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度 12 倍。六

12、、杜馬斯燃燒法原理Dumas法的基本原理是樣品在900C1200C高溫下燃燒，燃燒過程中產生混合氣體, 其中的干擾成分被一系列適當?shù)奈談┧眨?混合氣體中的氮氧化物被全部還原成分子 氮，隨后氮的含量被熱導檢測器檢測。燃燒，杜馬斯燃燒法是基于在高溫下（大約 900 C）， 通過控制進氧量、氧化消解樣品的原理而進行氮測定的。燃燒生成的氣體被載氣 CO2 攜帶 直接通過氧化銅作為催化劑） 而被完全氧化。 此外， 化合物中一定量的難氧化部分會被 載氣攜帶通過作為催化劑的氧化銅和鉑混合物進一步氧化。還原，燃燒生成的氮氧化物在 鎢上還原為分子氮，同時過量的氧也被結合了。一個傳感器用來控制最佳燃燒所需的

13、氧氣 量，這可以保證氧氣和鎢的消耗量最少。凈化，一系列的適當?shù)奈談⒏蓴_成分如鹵化 氫從被檢測氣流中除去。隨后的水冷器確保水蒸氣的去除。由于用CO2作載氣，所以沒必要 吸收燃燒生成的CO2。檢測，用一個TCD熱導檢測器來檢測CO2載氣流中剩余的氮。N2體積含量引發(fā)一種電子測量信號，通過它，再經過物質的獨立校正，被測樣品中的氮含量 就自動的計算、打印和存儲起來。特點用杜馬斯快速定氮儀每個測試只需3至5分鐘,并可以通過自動進樣器連續(xù)進樣,不需要 人看管;不需要復雜的樣品前處理過程;不產生有毒有害物質；操作簡便。七 、結語6種蛋白質測定方法比較如表1所示方法敏 度時間原理說明凱氏定 氮法靈敏度低，

14、適用于費時，810h將蛋白質轉化為 氮，酸吸收后滴定用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少； 費時太長雙縮脲 法靈敏度低適用于 120mg中速，810h多肽鍵+堿性Cu2+形成紫色絡合物用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯 色相似紫外吸 收法較為靈敏快速 510min蛋白質中的酪氨 酸和色氨酸殘基 在2 8 0 nm處 的光吸收用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以 校正考馬斯 亮藍法非常靈敏快速 515min考馬斯亮藍燃料 與蛋白質結合時， 光波由465nm變?yōu)?595nm干擾物質少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨蛋白質 不同而變化Folin酚 試劑法（L owry 法）非常靈敏費時多肽鍵+堿性Cu2

15、+形成紫色絡合物靈敏度高；費時；專一性較差；干擾物質較 多杜馬斯 燃燒法靈敏度低最快35min燃燒過程中產生 混合氣體，混合氣體中的氮氧化物 被全部還原成分 子氮，隨后氮的含量被熱導檢測器 檢測不產生有毒有害物質；操作簡便可以通過自 動進樣器連續(xù)進樣廣泛用于農產品中粗蛋 白含量的測定參考文獻李曉艷.淺談凱氏定氮法測定食品 中蛋白質注意事項J 計量與測試技 術2008年第35卷第8期張厚鋒 張淑萍.雙縮脲法和凱氏 定氮法測定飼料中蛋白質含量的比較研究 - 中國飼料料 2008(7)陳革 改良雙縮脲法測定飼料蛋白 質的應用研究 期刊論文 -飼料工業(yè)2003(3)4王雅 蛋白質測定實驗的研究 期 刊論文 -實驗室研究與探索2005(4)!A!5楊家華.謝占玲.愈芳.趙國