蛋白電泳異常分析

1、H松巨盹臼了 1幷干是為I魁怪合話前舟恥啟虐，E垛凰【話的盤格自I SD5-FAGE &TWSIU 下層肢h不同遙盧的d$_pge狩窗胺的曇桂好曲范因=5口占GE分蛋底般度50 150KD嚥底30-QtOkD20-BOO訛腹T2-60k315%藪注！如舷制菲匪性險(xiǎn) 彗都肉菽宵彷，刃蔑肢申不加10%SDSPr可配融用冼怪FAftFfo.SDS勒膠的有效分離范闔丙烯聯(lián)胺濃度L512.5107.55,01乩上業(yè)ThZOkDaLfi-lcDa30-J20kDa60-212 kDa1.配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？在SDS- PAG環(huán)連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是 Tris HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是，分離

2、膠； 而電泳緩沖液使用的 Tris -甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。 由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比， 這一區(qū)帶便形成 了較高的電壓剃度， 壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。 當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后， 同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解 決

3、問(wèn)題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。2樣品如何處理？工根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原 SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和 DTT （或 Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成 SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來(lái)分離。一 般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min,再離心加樣。2）帶有烷基化作用的還原 SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的 DTT,而防止銀染時(shí)的紋

4、理現(xiàn)象。100ul 樣品緩沖液中10ul 20 %的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3） 非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1 %SDS沸水中煮3min,未 加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來(lái)使用。SDS電泳凝膠中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇，分離膠選擇，選擇tris HCL系統(tǒng)，TEMED與 AP AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；十二烷基硫酸鈉（SDS :陽(yáng)離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋

5、白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、 去多肽折疊。提高SDS電泳分辨率的途徑？聚丙烯酰胺的充分聚合， 可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)P82-103。5“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！鞍櫭迹▋蛇呄蛳轮?/p>

6、間鼓起）形帶原因？ 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液， 加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 重新配制；降低凝膠濃度。為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？ _ 主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。什么是“鬼帶”，如何處理？“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失

7、去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 2我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確 pH值的Buffer ;降低分離膠的濃度。為什么電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當(dāng)

8、增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確（）；適當(dāng)降低電壓；為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。 比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽 沒(méi)有正確裝配，電流未形成通路。包括： a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過(guò)少；c.電泳槽底部的絕 緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：電泳槽正確裝配即可。濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎？這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中， 一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過(guò)猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。凝膠時(shí)間不對(duì)，或慢或快，怎么回事？通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該 現(xiàn)配現(xiàn)用，T