貝類中腹瀉性貝類毒素的測定 標準文本（食品安全國家標準）

1、 食品安全國家標準貝類中腹瀉性貝類毒素的測定范圍本標準適用于貝類及其制品中腹瀉性貝類毒素的測定。第一法為小鼠生物法，適用于腹瀉性貝類毒素總量測定；第二法為酶聯(lián)免疫吸附法，適用于腹瀉性貝類毒素篩查檢測；第三法為高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，適用于貝類可食部分及其制品（不包括鹽漬制品）中腹瀉性貝類毒素XX軟海綿酸（OA）、鰭藻毒素-1（DTX-1）、鰭藻毒素-2（DTX-2） 和鰭藻毒素-3（DTX-3）的測定及確證。第一法 小鼠生物法原理用丙酮提取貝類中DSP毒素，經(jīng)乙醚分配后，經(jīng)減壓蒸干，再以含1%吐溫-60的生理鹽水為分散介質(zhì)，制備DSP-1%吐溫-60生理鹽水混懸液，將該混懸液注射入小鼠腹腔，

2、觀察小鼠存活情況，計算其毒力。試劑和材料注:除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。3.1 丙酮（C3H6O）：分析純。3.2 無水乙醚（C4H10O）：分析純。3.3 1吐溫-60生理鹽水（C64H126O26）：稱取1.0 g吐溫-60，溶于生理鹽水（0.85 NaCl）中，并定容至100.0 mL。3.4 小鼠：體重為16 g20 g的健康ICR品系雄性小鼠。儀器和設(shè)備4.1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。4.2 圓底燒瓶：500 mL、250 mL、100 mL、50 mL。4.3 布氏漏斗。4.4 均質(zhì)器。4.5 天平：感量為0.1 g。4.6 一次性注射器：1 m

3、L。5 分析步驟5.1 試樣制備 5.1.1 樣品采集5.1.1.1樣品應(yīng)有充分的代表性。去殼貝肉、帶殼貝類或罐裝貝類樣品等，均應(yīng)采取足夠的數(shù)量并使貝肉達400 g以上。5.1.1.2 遠離實驗室不能及時送檢的樣品，除了在常溫下品質(zhì)不會發(fā)生變化的，應(yīng)將樣品置于保溫盒中冷凍送檢。如為帶殼樣品，應(yīng)按5.1.2的方法開殼，去除水分后冷凍送檢。5.1.2 樣品制備5.1.2.1 生鮮帶殼樣品的前處理用清水徹底洗凈貝類外殼，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其它異物，取出貝肉。嚴禁以加熱或藥物方法開殼。注意不要破壞閉殼肌以外的組織，尤其是中腸腺（又稱消化盲囊，組織呈暗綠色或褐綠色）。將去殼貝肉放

4、在孔徑約2 mm的金屬篩網(wǎng)上，瀝水5 min，按6.2.3制備檢樣。5.1.2.2 冷凍樣品的前處理在室溫下使冷凍樣品融化呈半冷凍狀態(tài)。帶殼冷凍的樣品按6.2.1方法清洗、開殼、淋洗取肉，此時的貝肉仍呈冷凍狀態(tài)，除去貝肉外部附著的冰片，用吸水紙輕輕抹去水分后，按6.2.3制備檢樣；事先已去除水分的冷凍去殼樣品，室溫融化后，按6.2.3制備檢樣。5.1.2.3 檢樣制備對于可以切取中腸腺的貝類（扇貝、貽貝及牡蠣等），稱量200 g貝肉后，仔細切取全部中腸腺，將中腸腺稱重后作為檢樣備用，注意不要使中腸腺內(nèi)容物污染制樣工具；不便切取中腸腺的貝類樣品，稱量200 g貝肉后，可將全部貝肉細切后混合，作為

5、檢樣。5.2 測定步驟5.2.1 試樣提取5.2.1.1 將檢樣置于均質(zhì)杯中，按體積比加3倍量丙酮后均質(zhì)2 min以上。如為小均質(zhì)杯，可分兩次操作。5.2.1.2 將均質(zhì)好的物質(zhì)倒入布氏漏斗中抽濾，收集濾液。5.2.1.3 對殘渣分別用殘渣2倍量的丙酮再清洗兩次，濾液與7.1.2濾液合并。5.2.1.4 將濾液移入500 mL的圓底燒瓶中，56 1 下，減壓濃縮去除丙酮直至在液體表面分離出油狀物。5.2.1.5 用100 mL200 mL乙醚溶解油狀物，倒入分液漏斗內(nèi)，再用少量的乙醚清洗圓底燒瓶，合并倒入分液漏斗內(nèi)，以少量的水洗下粘壁部分，輕輕振蕩（不能生成乳濁液），靜置分層后去除水層（下層）

6、。5.2.1.6 用相當(dāng)乙醚半量的蒸餾水洗乙醚層兩次，去除水層，再將乙醚層移入250 mL或500 mL的圓底燒瓶中，于351減壓濃縮去除乙醚。5.2.1.7 用少量乙醚將濃縮物移入50 mL或100 mL圓底燒瓶中，再次減壓濃縮去除乙醚。5.2.1.8 以1%吐溫-60的生理鹽水將全部濃縮物在刻度試管中稀釋到10 mL，充分振搖，制成均勻提取物-1%吐溫-60生理鹽水混懸液。此時1 mL溶液中相當(dāng)于含有20 g貝肉，以此混懸液為試驗原液。5.2.1.9 以試驗原液注射小鼠，24 h內(nèi)2只或3只小鼠死亡時，需將試驗原液按表1逐步稀釋，再注射小鼠。稀釋前，應(yīng)先振蕩使試液成均勻混懸液，再取其部分以

7、1%吐溫-60生理鹽水稀釋，注射前充分混勻。5.2.2 小鼠試驗5.2.2.1 選擇16 g20 g健康ICR雄性小鼠6只，隨機分為實驗組和溶劑對照組（1%吐溫-60生理鹽水）兩組，每組3只。5.2.2.2分別取1 mL待測液（試驗原液或其稀釋液）或1%吐溫-60生理鹽水腹腔注射小鼠。注射過程中若有提取液溢出，須將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠。仔細觀察并記錄死亡時間。死亡時間計算從注射完畢開始至小鼠停止呼吸（小鼠呼出最后一口氣止）為止。存活動物應(yīng)連續(xù)觀察24 h。5.2.2.3觀察時限24 h內(nèi)，在溶劑對照組小鼠正常的情況下，實驗組若出現(xiàn)2只或3只小鼠死亡，則按表1進一步實驗，以確定一組3

8、只小鼠中死亡2只或2只以上的最小染毒量或最大稀釋度。1 注射量、稀釋度與毒力的關(guān)系試驗液注射量（mL）檢樣量1）（g）毒力（MU/g）原液1.0200.05原液0.5100.14倍稀釋液1.050.24倍稀釋液0.52.50.416倍稀釋液1.01.250.816倍稀釋液0.50.6251.6注：1）以中腸腺為檢樣時，相當(dāng)于含有中腸腺的去殼肉量。6 分析結(jié)果的表述6.1 觀察時限24 h內(nèi)，在溶劑對照組小鼠正常的情況下，若實驗組無小鼠死亡或僅有1只小鼠死亡，則報告受檢樣品中DSP毒力為： 0.05 MU/g。6.2 觀察時限24 h內(nèi)，在溶劑對照組小鼠正常的情況下，若實驗組有2只或3只小鼠死亡

9、，則按5.2.2.3 進行動物實驗，并根據(jù)表1計算待檢樣品中DSP毒力，報告該樣品的毒力為： MU/g。 7 其他腹瀉性貝類毒素是一類劇毒的混合物，為避免腹瀉性貝類毒素對健康的危害，實驗過程自始至終應(yīng)戴手套操作。橡膠手套、玻璃制品等用過的器材應(yīng)在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 h以上，方可清洗或丟棄。同樣，廢棄的提取液等也應(yīng)以上述溶液浸泡后處理。小鼠尸體應(yīng)按GB 14925 要求焚燒處理，其排放物應(yīng)達到污物焚燒排放規(guī)定要求。第二法 酶聯(lián)免疫吸附法8 原理方法根據(jù)競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng)，游離的腹瀉性貝類毒素與腹瀉性貝類毒素酶標記物競爭腹瀉性貝類毒素抗體。沒有被結(jié)合的酶標記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)和

10、顯色劑加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm波長的酶標儀測量微孔溶液的吸光度值，樣品中的腹瀉性貝類毒素溶液與吸光度值成反比，按繪制的校正曲線定量計算。 試劑和材料注: 除另有規(guī)定外，所有化學(xué)試劑均為分析純，水為重蒸餾水。9.1 90%甲醇溶液。 半對數(shù)坐標紙。9.3 DSP標準物質(zhì)。9.4 酶標記物。9.5 包被有腹瀉性貝類毒素抗體的微孔板。9.6 基質(zhì)（過氧化尿素）/發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）。 反應(yīng)終止液: 1 mol/L硫酸。 商業(yè)化試劑盒若評價技術(shù)參數(shù)達到本標準的要求則也適合于本標準（附錄B）。10 儀器和設(shè)備

11、酶標儀。 均質(zhì)器。 離心機：4 3000 g。 微量加樣器：50 L。 微量多通道加樣器：50 L，100 L。11 分析步驟11.1 試樣的提取稱取10.0 g試樣（精確至0.1 g），加入5倍90%甲醇溶液，均質(zhì)1 min2 min，3000 g離心10 min，離心后取上清液，用重蒸餾水按1：2稀釋，取50 L按11.2進行酶聯(lián)免疫測定。此時的稀釋倍數(shù)是10。高濃度的樣品，如超出標準曲線范圍，可進一步用90%甲醇溶液稀釋，直至測定值在標準曲線范圍以內(nèi)。11.2 酶聯(lián)免疫測定將足夠數(shù)量的微孔條插入微孔架（標準液和樣液分別做復(fù)孔），記錄標準液和樣液的位置。加入50 L 25個腹瀉性貝類毒素標

12、準液和樣液到各自的微孔，每個標準液和樣液必須使用新的吸頭，加入50 L腹瀉性貝類毒素酶標記物至每個微孔，迅速充分混合，22 25 避光處孵育10 min。將微孔架倒置在吸水紙上拍打數(shù)次，以保證完全除去微孔中的液體，每個微孔注入250 L洗液沖洗后拍干，再重復(fù)以上洗板操作4次。加入50 L發(fā)色劑至每個微孔中，輕拍混勻，22 25 黑暗避光處孵育6 min。加入50 L反應(yīng)終止液至每個微孔中，迅速混勻后，在10 min內(nèi)以空氣為空白調(diào)零，測量并記錄每個微孔溶液450 nm波長的吸光度值。12 分析結(jié)果的計算與表述12.1 計算百分比吸光度值計算腹瀉性貝類毒素標準液和樣液的平均吸光度值，按公式（1）

13、分別求得每個腹瀉性貝類毒素標準液和空白液的百分比吸光度值： A S100%（1）S0式中：A百分比吸光度值；S腹瀉性貝類毒素標準液或樣液的平均吸光度值；S00 g/L的腹瀉性貝類毒素標準液的平均吸光度值。 繪制標準曲線以百分比吸光度值（算術(shù)級）為縱坐標，以腹瀉性貝類毒素濃度（g/kg）（對數(shù)級）為橫坐標，繪制出腹瀉性貝類毒素標準液百分比吸光度值與腹瀉性貝類毒素濃度的標準曲線。每次試驗均應(yīng)重新繪制標準曲線。12.3 結(jié)果的計算在12.2繪制的標準曲線上，樣液百分比吸光度值所對應(yīng)的腹瀉性貝類毒素濃度即為試樣中腹瀉性貝類毒素含量（g/kg）。12.4 結(jié)果的表述當(dāng)測定值10 g/kg時，則報告腹瀉性

14、貝類毒素含量10 g/kg。當(dāng)測定值10 g/kg時，則報告實際測定數(shù)值。13 其他13.1 測定低限方法的測定低限為10 g/kg。13.2 回收率方法的回收率為85 % 90 %。13.3 健康和安全任何腹瀉性貝類毒素含量值大于16 g -20 g/100 g的樣品即被認為是有害的，對人類食用不安全。標準液含有腹瀉性貝類毒素，應(yīng)特別小心，避免接觸。反應(yīng)終止液為1 mol/L硫酸，避免接觸皮膚。第三法 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法14 原理試樣經(jīng)100%甲醇提取，聚合物型固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，以基質(zhì)校正標準曲線進行外標法定量。15 試劑和材料注: 除非另有說明，本方法所用

15、試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 甲醇（CH3OH）：色譜純。 乙腈（CH3CN）：色譜純。 氨水（NH3H2O）：優(yōu)級純，濃度25%。 氫氧化鈉（NaOH）。 鹽酸（HCl）：濃度36%。 碳酸氫銨（NH4HCO3） ：色譜純。 甲醇溶液（30%）：量取30 mL甲醇（15.1）加到70 mL水中，混合均勻。 甲醇溶液（20%）：量取20 mL甲醇（15.1）加到80 mL水中，混合均勻。 氨水甲醇溶液（0.3%）：吸取0.3 mL氨水（15.3），用甲醇定容至100 mL。15.10 氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L）：準確稱取50 g氫氧化鈉（15.4），用水溶解并定

16、容至500 mL。15.11 鹽酸溶液（2.5 mol/L）：準確量取104.5 mL鹽酸（15.5），用水定容至500 mL。15.12 流動相A（2 mmol/L碳酸氫銨，pH=11）：準確稱取79 mg碳酸氫銨（15.6）用30 mL水將其全部溶解，加入7.5mL氨水（15.3），加水定容至500 mL，檢查pH，室溫下可保存48 h。 流動相B（乙腈+2 mmol/L碳酸氫銨=9+1，pH=11）：準確稱取79 mg碳酸氫銨（15.6）用33 Ml水將其全部溶解，加入17.5 mL氨水（15.3），加乙腈定容至500 mL，檢查pH，室溫下可保存48 h。 XX軟海綿酸（C44H68O

17、13）標準溶液：14.24 g/mL。 鰭藻毒素-1（DTX-1，C45H70O13）標準溶液：15.15 g/mL。 鰭藻毒素-2（DTX-2，C44H68O13）標準溶液：7.80 g/mL。15.17 混合標準中間液：分別吸取適量的各標準溶液（15.14、15.15和15.16）于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，使其濃度分別為：OA 1.0 g/mL，DTX-1 1.0 g/mL，DTX-2 1.0 g/mL。-18以下避光保存，保存期1個月。15.18 基質(zhì)校正標準曲線工作液：取5份空白試樣，分別加入適量上述各濃度混合標準溶液，按17.2和17.3步驟處理，制成OA、DTX-1

18、、DTX-2的濃度為20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL的基質(zhì)校正標準系列工作液，過0.22 m濾膜后備用。15.19 固相萃取柱：StrataTM-X硅膠表面修飾苯乙烯二乙烯基苯聚合物型固相萃取柱StrataTM-X硅膠表面修飾苯乙烯二乙烯基苯聚合物型固相萃取柱是Phenomenex公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。，StrataTM-X硅膠表面修飾苯乙烯二乙烯基苯聚合物型固相萃取柱是Phenomenex公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一

19、信息是為了方便本標準的使用者，并不是表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。 濾膜：0.22 m。16 儀器和設(shè)備16.1 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。 分析天平：感量為0.01g。 組織均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速20000 轉(zhuǎn)/分鐘。 渦旋振蕩器。 離心機：轉(zhuǎn)速8000 轉(zhuǎn)/分鐘。 超聲波清洗器。 恒溫干燥箱。 固相萃取裝置。 真空泵。16.10 氮吹儀。 pH計。 具塞離心管：15 mL。 刻度玻璃離心管：10 mL。 螺紋口樣品瓶：9.5 mL17 分析步驟17.1 試樣制備 洗凈貝類樣品外殼泥沙后，開殼，再清洗凈內(nèi)部，確保樣品無海水和泥沙等異物。取貝

20、類組織可食部分，瀝干水分后備用。以上貝類及其他貝類制品經(jīng)充分攪碎、均質(zhì)，分出0.5 kg作為試樣，置于清潔樣品容器中，密封，并做上標記。在試樣制備的操作過程中，應(yīng)防止樣品污染或發(fā)生殘留物含量的變化。試樣置于-18以下避光保存。 試樣提取 17.2.1 DSP毒素提取稱取2.00 g（精確到0.01 g）試樣于15 mL具塞離心管中，加入5 mL甲醇，渦旋混合1 min，超聲提取5 min。8000 r/min下離心5 min，取上清液于10 mL刻度玻璃離心管中。殘渣中加入5 mL甲醇，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。于40氮氣吹至近干，用1 mL甲醇溶解殘渣，備用。17.2.2 酯化態(tài)DSP（

21、DTX-3）毒素水解釋放取步驟17.2.1所得1 mL甲醇提取液于9.5 mL螺紋口樣品瓶中，加入2.5 mol/L NaOH溶液313 L，混勻后用密封膜將樣品瓶密封，于76下溫育40 min。樣品瓶冷至室溫后，加入2.5 mol/L HCl溶液313 L并混勻，所得試樣溶液可直接過0.22 m濾膜后，供LC-MS/MS測定，或者必要時進行凈化處理。17.3 試樣凈化（必要時） 步驟17.2.2所得試樣溶液用3 mL水稀釋，渦旋混勻后，移入依次用1 mL甲醇、1 mL 30%甲醇溶液活化的聚合物型固相萃取柱上，待液體以1 mL/min的流速流出后，再用1 mL 20%甲醇溶液淋洗，棄去流出液

22、，最后用1 mL 0.3%氨水甲醇溶液洗脫吸附在柱上的腹瀉性貝類毒素，保持抽氣2 min，收集洗脫液，甲醇定容至1 mL，過0.22 m濾膜后，供LC-MS/MS測定。17.4 儀器參考條件17.4.1 液相色譜參考條件：色譜柱：X-Bridge C18柱X-Bridge C18柱是Waters公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。），150 mm 3 mm （i.d.），3.5 m，或相當(dāng)者X-Bridge C18柱是Waters公司產(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不是

23、表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。流速：0.4 mL/min；柱溫：35；進樣量：10 L；流動相：A為2 mmol/L碳酸氫銨溶液（pH=11），B為乙腈+2 mmol/L碳酸氫銨（9+1，v/v）溶液（pH=11），梯度洗脫程序見表2。表2 流動相梯度洗脫程序時間 （min）A （%）B （ %）0.090101.0901010.0109013.1109015.020.09090101017.4.2 質(zhì)譜參考條件離子源：電噴霧離子源；掃描模式：負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓（IS）：-4000 V；霧化氣壓力（GS1）：60 Psi；氣

24、簾氣壓力（CUR）：15 Psi；碰撞氣壓力（CAD）：12 Psi；輔助氣流速（GS2）：70 L/min；離子源溫度（TEM）：550 ；母離子、子離子及去簇電壓和碰撞能量見表3。表3 腹瀉性貝類毒素多反應(yīng)監(jiān)測模式下母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量目標化合物母離子（m/z）子離子（m/z）去簇電壓（DP/V）碰撞能量（CE/ ev）XX軟海綿酸（OA）803.4255.3*-130-65113.1-130-90鰭藻毒素-1（DTX-1）817.4255.2*-90-48150.8-90-48鰭藻毒素-2（DTX-2）803.8255.3*-130-65113.1-130-90*代表定量離

25、子17.5 基質(zhì)校正標準曲線的制作將基質(zhì)校正標準系列工作液分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。17.6 試樣溶液的測定將試樣溶液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到峰面積，根據(jù)基質(zhì)校正標準曲線得到待測液中腹瀉性貝類毒素的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。17.6.1 定性測定在同樣測試條件下，試樣溶液中與標準溶液中腹瀉性貝類毒素的保留時間之比，偏差在5%以內(nèi)，且檢測到的離子的相對豐度，應(yīng)當(dāng)與濃度相近的標準工作液中離子的相對豐度一致，其豐度比偏差應(yīng)符合表4要求。表4 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度50%2

26、0%至50%10%至20%10%允許的相對偏差20%25%30%50%17.6.2 定量測定取試樣溶液和相應(yīng)的標準溶液等體積進樣測定，按外標法以標準曲線對樣品進行定量。標準溶液及試樣溶液中腹瀉性貝類毒素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。腹瀉性貝類毒素標準溶液總離子流圖參見附錄C。18 空白實驗 除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。19 分析結(jié)果的表述19.1 試樣中腹瀉性貝類毒素含量按公式（2）計算： （2）式中：Xi 試樣中腹瀉性貝類毒素的含量，單位為微克每千克（g/kg）；ci 從基質(zhì)校正標準曲線中得到的試樣中腹瀉性貝類毒素溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；c0 從基質(zhì)校正標準曲線中得到的空白試驗中腹瀉性貝類毒素溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V樣品溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；m 最終樣品溶液所代表試樣質(zhì)量，單位為克（g）；以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。19.2 毒性轉(zhuǎn)換按照國際慣例，腹瀉性貝類毒素的毒性因子見表5。試樣中腹瀉性貝類毒素的含量則按照毒性因子，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為OAeq來表示，計算公式（3）： （3）Xi 各種腹瀉性貝類毒素的含量ri 毒性因子表5腹瀉性貝類毒素毒性因子（