植物組培培養(yǎng)基及其配制

1、植物組培培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基好比土壤，是組織培養(yǎng)中離體材料賴以生存和發(fā)展的基地。因此，在組織培養(yǎng)基的各個環(huán)節(jié)中，應著重掌握培養(yǎng)基，了解它的組成和配制方法。一、組成培養(yǎng)基的五類成分目前，大多數(shù)培養(yǎng)基的成分是由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機附加物等五類物質(zhì)組成的。.無機營養(yǎng)物無機營養(yǎng)物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素中，氮源通常有硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中用硝態(tài)氮的較多，也有將硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合使用的。磷和硫則常用磷酸鹽和硫酸鹽來提供。鉀是培養(yǎng)基中主要的陽離子，在近代的培養(yǎng)基中，其數(shù)量有逐漸提高的趨勢。而鈣、鈉、鎂的需要則較少。培養(yǎng)基所需的鈉和氯化物，由鈣鹽、磷酸鹽或微

2、量營養(yǎng)物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鉆和鐵。培養(yǎng)基中的鐵離子，大多以螯合鐵的形式存在，即FeSO4與Na2EDTA(螯合劑)的混合。.碳源培養(yǎng)的植物組織或細胞，它們的光合作用較弱。因此，需要在培養(yǎng)基中附加一些碳水化合物以供需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作為培養(yǎng)基內(nèi)的碳源和能源外，對維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用。.維生素在培養(yǎng)基中加入維生素，常有利于外植體的發(fā)育。培養(yǎng)基中的維生素屬于B族維生素，其中效果最佳的有維生素B1、維生素B6、生物素、泛酸鈣和肌醇等。.有機附加物包括人工合成或天然的有機附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各種氨基酸等。另外，瓊脂也是

3、最常用的有機附加物，它主要是作為培養(yǎng)基的支持物，使培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，以利于各種外植體的培養(yǎng)。.生長調(diào)節(jié)物質(zhì)常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)大致包括以下三類：植物生長素類。如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。(2)細胞分裂素。如玉米素(Zt)、6-芐基嘌呤(6-BA或BAP)和激動素(Kt)。赤霉素。組織培養(yǎng)中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸(GA3)。二、常用培養(yǎng)基配方及其特點.常用培養(yǎng)基配方組織培養(yǎng)是否成功,在很大程度上取決于對培養(yǎng)基的選擇。不同培養(yǎng)基有不同特點,適合于不同的植物種類和接種材料。開展組織培養(yǎng)活動時,應對各種培養(yǎng)基進行了解和分析,以便能從中選擇使用。下面

4、介紹組織培養(yǎng)幾種常用培養(yǎng)基的配方見表91。培養(yǎng)基中的激素種類和數(shù)量,隨著不同培養(yǎng)階段和不同材料而有變化,因此各配方中均不列入。.幾種常用培養(yǎng)基的特點MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基是目前普遍使用的培養(yǎng)基。它有較高的無機鹽濃度，對保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)和加速愈傷組織的生長十分有利。由于配方中的離子濃度高,在配制、貯存、消毒等過程中,即使有些成分略有出入,也不致影響離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用來誘導愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)，它的液體培養(yǎng)基用于細胞懸浮培養(yǎng)時能獲得明顯成功。這種培養(yǎng)基中的無機養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細胞在營養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，無須再添加氨

5、基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機附加成分。與其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的明顯特點。B5培養(yǎng)基。B5培養(yǎng)基的主要特點是含有較低的銨，這是因為銨可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，有些植物的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物在MS培養(yǎng)基上生長得比B5培養(yǎng)基上要好，而另一些植物，在B5培養(yǎng)基上更適宜。N6培養(yǎng)基。N6培養(yǎng)基特別適合于禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng)，在國內(nèi)外得到廣泛應用。在組織培養(yǎng)中，經(jīng)常采用的還有懷想While，1963)培養(yǎng)基、尼許(Nitsch，1951)培養(yǎng)基等。它們在基本成分上大同小異。懷特培養(yǎng)基由于無機鹽的數(shù)量比較低，更適合

6、木本植物的組織培養(yǎng)。三、培養(yǎng)液的配制.制備母液為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對幾十種化學藥品進行稱量，應該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋，即成培養(yǎng)液。現(xiàn)將培養(yǎng)液中各類物質(zhì)制備母液的方法說明如下。(1)大量元素。大量元素包括硝酸銨等用量較大的幾種化合物。制備時，按表中排列的順序，以其10倍的用量，分別稱出并進行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸餾水，使其總量達到1升，此即大量元素母液。(2)微量元素。因用量少，為稱量方便和精確起見，應配成100倍或1000倍的

7、母液。配制時，每種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。(3)鐵鹽。鐵鹽要單獨配制。由硫酸亞鐵(FeSO4-7H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二鈉(NaEDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培養(yǎng)基，加鐵鹽5毫升。(4)有機物質(zhì)。主要指氨基酸和維生素類物質(zhì)。它們都是分別稱量，分別配成所需的濃度(0.11.0毫克/毫升)，用時按培養(yǎng)基配方中要求的量分別加入。(5)植物激素。最常用的有生長素和細胞分裂素。這類物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.0110毫克/升?？砂从昧康?00倍或1000倍配制母液，配制時要單個稱量，分別貯藏。配制植物生長素時，應先按要求濃度稱好

8、藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用12毫升0.1用充當量濃度)氫氧化鈉溶解，再加蒸餾水稀釋至所需濃度。配制細胞分裂素時，應先用少量0.5或1N的鹽酸溶解，然后加蒸餾水至所需量。以上各種混合液(母液)或單獨配制藥品，均應放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱隨用。.配制培養(yǎng)基的具體操作根據(jù)配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用粗天平稱取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。將中稱好的瓊脂加蒸餾水300400毫升，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。將中所取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中，再加水至1000毫升，攪拌均勻，配

9、成培養(yǎng)基。 用1N的氫氧化鈉或鹽酸，滴入中的培養(yǎng)基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用pH試紙測其pH值，直到將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5.8。將配好的培養(yǎng)基，用漏斗分裝到三角瓶（或試管）中，并用棉塞塞緊瓶口，瓶壁寫上號碼。瓶中培養(yǎng)基的量約為容量的1/4或1/5。培養(yǎng)基的成分比較復雜，為避免配制時忙亂而將一些成分漏掉，可以準備一份配制培養(yǎng)基的成分單，將培養(yǎng)基的全部成分和用量填寫清楚。配制時，按表列內(nèi)容順序，按項按量稱取，就不會出現(xiàn)差錯。成分單的格式與內(nèi)容見表92。.培養(yǎng)基的滅菌與保存培養(yǎng)基配制完畢后，應立即滅菌。培養(yǎng)基通常應在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在汽相120條件下，滅菌20分鐘。如果沒有高壓蒸汽滅菌鍋

10、，也可采用間歇滅菌法進行滅菌，即將培養(yǎng)基煮沸10分鐘，24小時后再煮沸20分鐘，如此連續(xù)滅菌三次，即可達到完全滅菌的目的。經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基應置于10下保存，特別是含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基，在45低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的一周內(nèi)使用完，其它培養(yǎng)基最多也不應超過一個月。在多數(shù)情況下，應在消毒后兩周內(nèi)用完。組培室設(shè)計規(guī)劃之儀器設(shè)備配置篇在植物組織培養(yǎng)過程中，根據(jù)所培養(yǎng)的植物種類、生產(chǎn)規(guī)模，選擇合適的器材、設(shè)施是十分必要的，只有這樣才能確保整個操作過程的順利進行。在器材、設(shè)施的選擇上，不要貪大求洋，應該在其是否實用上多下功夫。在研究型的組織培養(yǎng)操作中，往往對器材、設(shè)施

11、的要求較高；而在生產(chǎn)型的組織培養(yǎng)中，則對器材、設(shè)施的要求卻較為粗放，因此管理者必須根據(jù)實際情況來進行培養(yǎng)器材、設(shè)施的遴選。在植物組織培養(yǎng)的過程中，從外植體的采收到試管苗的定植都必須要在特定的環(huán)境中進行，例如，培養(yǎng)基的配制要在專用的器材、設(shè)施中進行；外植體的接種要在專用的器材、設(shè)施中進行。應該根據(jù)植物組織培養(yǎng)不同階段的需要，選擇不同的器材、設(shè)施。只有從降低投入、提高工效、節(jié)約勞力等諸方面加以考慮，才能降低培養(yǎng)成本、提高培養(yǎng)效率。在植物組織培養(yǎng)過程中，所使用的器材種類較多，但它們通?？梢苑譃橥ㄓ闷骶?、盛具、計量器械、滅菌器械、接種器械、培養(yǎng)器械等幾種類型。在使用這些容器、設(shè)備時，必須要了解它們的基

12、本用途，并學會它們的基本用法。例如，不能給容量瓶加熱；必須用磨砂玻璃燈罩來熄滅正在燃燒的酒精燈；應該定期更換超凈工作如的無菌濾膜等等。詳細操作可參考具體設(shè)備、容器的使用說明。（1）通用器械燒杯：用來盛放、溶解化學藥劑等。常用的規(guī)格有50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml。烘箱：用來烘干器械。恒溫水?。河脕砣芙猸傊任镔|(zhì)。玻璃攪拌棒：用來配制培養(yǎng)基。洗耳球：用來輔助吸取、轉(zhuǎn)移少量液體。冰箱：用來貯存化學藥劑、植物材料等。牛角勺：用來轉(zhuǎn)移化學藥劑。玻璃漏斗：用來過濾溶液。剪刀：用來修剪外植體或剪切嫩莖。器械架：在無菌操作期間用來放置滅菌的器械。（2）各種盛具搪瓷淺盤：用來承載各

13、種器械容器。塑料盆：用于清洗培養(yǎng)容器。鐵絲筐：用來盛放滅菌容器等物品。純水水桶：用來存放去離子水或蒸餾水。常用的規(guī)格有10L、20L。塑料桶：用來存放洗滌溶液、廢棄溶液。各種規(guī)格的磨砂玻璃瓶：用來盛放培養(yǎng)母液，以及各種植物生長物質(zhì)。（3）計量器械量筒：用來量取一定體積的液體。常用的規(guī)格有25ml、50ml、100ml、500ml、1000ml。容量瓶：用來配制標準溶液。常用的規(guī)格有50ml、100ml、500ml、1000ml。大肚移液管：用來吸取定量溶液。常用的規(guī)格有1ml、5ml、10ml?？潭纫埔汗埽河脕砦《恐参锷L物質(zhì)溶液。常用的規(guī)格有1ml、5ml、10ml。移液管架：用來放置、

14、固定移液管。酸度計：用來檢測培養(yǎng)基的pH。藥物天平：用來稱取配制培養(yǎng)基的藥品。分析天平：用來稱取少量有化學試劑，進行化學分析。（4）滅菌器械磨砂口玻璃瓶：用來對植物材料進行表面滅菌。酒精燈：用來進行接種器材的表面滅菌。細菌過濾器：用來過濾不能進行高溫滅菌的試劑溶液。無菌濾紙：用來汲取器材、植物材料表面的水分。無菌脫脂棉：用來進行器械、植物材料表面的滅菌處理。真空泵：用來吸濾滅菌。高壓滅菌鍋：對培養(yǎng)基、接種器材進行滅菌處理。可調(diào)試電爐：用來加熱高壓滅菌鍋。皮下注射器：用來對溶液進行過濾、除菌。紫外線滅菌燈：用來對接種室、培養(yǎng)室、操作室等工作環(huán)境進行滅菌處理。（5）接種器械超凈工作臺：用來過濾通過

15、接種工作臺面的空氣，以便進行無菌操作。小型噴霧器：裝載滅菌藥液，來給超凈工作臺等處噴霧滅菌。鈍頭鑷子：在接種操作、繼代培養(yǎng)時移取植物材料。尖頭鑷子：用來分離植物材料。解剖刀：用來切割植物材料。打孔器：用來切取大小一致的圓柱形植物材料。雙目顯微鏡：在解剖較小的外植體時，用來觀測材料。細菌濾膜：用來進行溶液的常溫除菌。接種針：用來轉(zhuǎn)移細胞團、愈傷組織。（6）培養(yǎng)器械試管：用來作為外植體的培養(yǎng)容器。常用的規(guī)格有2cmX15cm、3cmX15cm。培養(yǎng)皿：用來作為外植體的培養(yǎng)容器。常用的規(guī)格有直徑9cm、12cm。錐形瓶：即三角燒瓶，主要作為培養(yǎng)器材，常用的規(guī)格有50ml、100ml。顯微鏡：用來觀察

16、植物材料。成套載玻片：用來制作植物材料顯微制片。鋁箔：用于培養(yǎng)容器封口。橡皮筋：用來束緊培養(yǎng)容器的封口材料。血球計數(shù)器：用來進行植物細胞計數(shù)?？照{(diào)：用來調(diào)節(jié)操作間、培養(yǎng)室的溫度。搖床：用來進行細胞懸浮培養(yǎng)。MS培養(yǎng)基MSMedium用途：用于植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：（睚）成分分子量使用濃度（mg/L）大量元素硝酸鉀KNO3101.111900硝酸銨NH4NO380.041650磷酸二氫鉀KH2PO4136.09170硫酸鎂MgSO4.7H2O246.47370氯化鈣CaCl2.2H2O147.02440微量元素碘化鉀KI166.010.83硼酸H3BO361.836.2硫酸錳MnSO4.

17、4H2O223.0122.3硫酸鋅ZnSO4.7H2O287.548.6鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O241.950.25硫酸銅CuSO4.5H2O249.680.025氯化鈷CoCl2.62237.930.025鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA372.2537.3硫酸亞鐵FeSO24.7H2O278.0327.8有機成分肌醇100甘氨酸2鹽酸硫胺素VB10.1鹽酸吡哆醇VB60.5煙酸VB5或VPP0.5蔗糖sucrose342.3130g/L瓊脂agar7g/LMS培養(yǎng)基相關(guān)產(chǎn)品：我公司亦生產(chǎn)成分不同含量的MS培養(yǎng)基，主要有:1/2MS培養(yǎng)基，1/4MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基(不含瓊脂/不

18、含瓊脂和蔗糖/不含有機元素、不含瓊脂和蔗糖)等各種類型。如果有特殊需要可按需定制培養(yǎng)基。B5培養(yǎng)基B5Medium用途：用于植物組織培養(yǎng)配方：(g/L).無機物(mg/L):磷酸二氫(NaH2PO4.H2O)無水氯化鈣硝酸鉀硫酸銨無水硫酸鎂乙二胺四乙酸二鈉硫酸亞鐵(FeSO4-7H2O)硫酸錳(MnSO4-2H2O)硫酸鋅(ZnSO4-7H2O)硼酸鉬酸鈉(Na2MoSO4-2H2O)硫酸銅(CuSO4-5H2O)氯化鈷(CoCl2-6H2O)碘化鉀.有機物(mg/L):維生素B1(鹽酸硫胺素)維生素B6(鹽酸吡哆醇)煙酸肌醇蔗糖瓊脂pH值5.5150113.242500134122.0937.327.810.02.03.00.250.0250.0250.7510.01.01.0100.020000700025產(chǎn)品用法：稱取本品30.21g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,116高壓滅菌30分鐘備用。注意:如果pH值偏高，請用稀鹽酸調(diào)整pH值至5.5。產(chǎn)品說明：B5培養(yǎng)基的主要特點是含有較低的銨，這是因為銨可能對不少培