免疫沉淀實(shí)驗(yàn)課件

1、實(shí)驗(yàn)一免疫沉淀類(lèi)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)一免疫沉淀類(lèi)反應(yīng)免疫沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在溶液或凝膠中接觸形成肉眼可見(jiàn)的抗原抗體復(fù)合物沉淀稱(chēng)為免疫沉淀反應(yīng)。免疫沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在溶液或凝膠中接觸形成肉眼沉淀反應(yīng)環(huán)狀沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)電泳技術(shù)火箭免疫電泳對(duì)流免疫電泳雙向擴(kuò)散試驗(yàn)沉環(huán)狀沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)電火箭免一、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴(kuò)散，彼此相遇，在濃度比例適當(dāng)處形成沉淀線(xiàn)。根據(jù)沉淀線(xiàn)的有無(wú)、形狀和位置對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性分析，也可用于抗體的半定量檢測(cè)本次實(shí)驗(yàn)利用此原理進(jìn)行抗體效價(jià)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理一、雙向免疫擴(kuò)散

2、試驗(yàn)指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴(kuò)ABCABC試劑與器材 抗體：兔抗人全血清 抗原：人血清 10-15g/L 瓊脂（以生理鹽水配制） 載玻片、打孔器、微量進(jìn)樣器 37水浴箱試劑與器材 抗體：兔抗人全血清 制板 取加熱融化的鹽水瓊脂約4ml，均勻澆在水平放置的載玻片上，使成厚度約為1.5mm的瓊脂板，待冷凝。打孔 打梅花孔（如圖），各孔間的距離為4-5mm。實(shí)驗(yàn)步驟1制板 取加熱融化的鹽水瓊脂約4ml，均勻澆在水平放置的載玻片倍比稀釋抗體 （見(jiàn)下表）加樣 用微量加樣器分別取抗原、抗體10ul加入各孔。中央孔加10ul抗原，周?chē)?孔分別加不同稀釋度的抗體。溫育 將玻片放在濕盒中，37溫育

3、24h，觀(guān)察沉淀線(xiàn)。123456生理鹽水2525252525抗人血清502525252525倍比稀釋抗體 （見(jiàn)下表）123456生理鹽水25252525在抗原和抗體孔之間會(huì)看到白色的沉淀線(xiàn)，將出現(xiàn)白色沉淀線(xiàn)的抗體最高稀釋孔作為該抗體的效價(jià)。 結(jié)果判斷在抗原和抗體孔之間會(huì)看到白色的沉淀線(xiàn)，將出現(xiàn)白色沉淀線(xiàn)的抗體應(yīng)用 檢測(cè)未知抗原或抗體 抗原性質(zhì)分析 抗體效價(jià)滴定 抗原或抗體純度鑒定應(yīng)用 檢測(cè)未知抗原或抗體玻片要清潔，邊緣無(wú)破損。澆制瓊脂板時(shí)要均勻、無(wú)氣泡?？滓虻脠A整光滑，邊緣不要破裂，底部勿與載玻片脫離。加樣時(shí)應(yīng)盡量避免氣泡或加到孔外，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。反應(yīng)時(shí)間要適宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，沉淀線(xiàn)可解離

4、而導(dǎo) 致假陰性、不出現(xiàn)或不清楚。注意事項(xiàng)玻片要清潔，邊緣無(wú)破損。注意事項(xiàng)對(duì)流免疫電泳是將雙向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。在pH8.6的緩沖液中，抗原帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)；抗體在電滲作用下向負(fù)極移動(dòng)。在兩者相遇的最適比例處形成白色沉淀線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)原理二、對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳是將雙向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理免疫沉淀實(shí)驗(yàn)課件抗原：人全血清抗體：兔抗人全血清1瓊脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥緩沖液配制電泳槽、電泳儀、載玻片、水浴箱、打孔器、微量加樣器試劑和器材抗原：人全血清試劑和器材制板 取已經(jīng)融化的1%瓊脂約4ml，加到水平放置的載玻片上，使成厚度約為1.5mm的瓊脂

5、板，待冷凝。打孔 用打孔器打孔，孔徑3mm，兩孔間隔4-5mm。（如下圖所示）實(shí)驗(yàn)步驟制板 取已經(jīng)融化的1%瓊脂約4ml，加到水平放置的載玻片上，加樣 用微量加樣器分別取10vl抗原、抗體，按圖加樣。+AgAb人血清羊抗人血清生理鹽水加樣 用微量加樣器分別取10vl抗原、抗體，按圖加樣。+A 電泳 將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)（抗原端放陰極側(cè)，抗體端放陽(yáng)極側(cè)），兩端貼上用電泳液浸濕的紗布。通電，調(diào)整電壓為4V/cm長(zhǎng)或電流3-4mA/cm寬，電泳30min-1h。 電泳 將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)（抗原端放陰極側(cè)，抗體端放陽(yáng)極側(cè)結(jié)果判斷在黑色背景上方，用散射光多個(gè)角度觀(guān)察，在對(duì)孔之間是否有白色沉淀線(xiàn)出現(xiàn)。如

6、果沉淀線(xiàn)不清晰，可將瓊脂板放入濕盒于37保溫?cái)?shù)小時(shí)，可增強(qiáng)沉淀線(xiàn)的清晰度。結(jié)果判斷在黑色背景上方，用散射光多個(gè)角度觀(guān)察，在對(duì)孔之間是否注意事項(xiàng)加樣時(shí)不要起氣泡，勿溢出瓊脂孔?？乖?、抗體的量應(yīng)相近，如抗原量過(guò)多， 可造成假陰性結(jié)果，須通過(guò)稀釋抗原加以解決。電泳時(shí)電壓不宜過(guò)高或過(guò)低，過(guò)高可能會(huì)將瓊脂拉斷；過(guò)低時(shí)沉淀線(xiàn)出現(xiàn)的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。注意事項(xiàng)加樣時(shí)不要起氣泡，勿溢出瓊脂孔。 結(jié)束語(yǔ)當(dāng)你盡了自己的最大努力時(shí)，失敗也是偉大的，所以不要放棄，堅(jiān)持就是正確的。When You Do Your Best, Failure Is Great, So DonT Give Up, Stick To The End 結(jié)束語(yǔ)