對(duì)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的探究課件

1、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的研究進(jìn)展紫杉醇紫杉醇是紅豆杉屬植物的樹(shù)皮中提出的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，屬于二萜類衍生物。是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。通過(guò)臨床相關(guān)研究，紫杉醇是目前公認(rèn)的廣譜、活性強(qiáng)的抗癌藥物之一。由于其具有顯著抗癌效果，現(xiàn)已成為臨床上治療腫瘤的重要藥物。 關(guān)于腫瘤腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人們生命和生活質(zhì)量的重大和主要疾病。我國(guó)國(guó)內(nèi)每年新發(fā)生癌癥患者160 萬(wàn)人, 并有130 萬(wàn)人死于癌癥。發(fā)達(dá)國(guó)家美、歐、日等每年新增的癌癥患者達(dá)400 萬(wàn)人左右, 全世界癌癥死亡人數(shù)每年達(dá)630 萬(wàn)人。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，在21世紀(jì)，癌癥將取代心腦血管病成為人類的“第一殺手

2、”。 抗癌機(jī)理對(duì)于迅速分裂的腫瘤細(xì)胞，紫杉醇“凍結(jié)”有絲分裂紡錘體，抑制微管解聚，使腫瘤細(xì)胞停止在G2期和M期于，從而導(dǎo)致有絲分裂異?；蛲Ｖ?，直至死亡。 紫杉醇也作用于巨噬細(xì)胞上的腫瘤壞死因子(TNF)受體，促使釋放白細(xì)胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干擾素(IFN)-1、IFN-2對(duì)腫瘤細(xì)胞起殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞遷移作用。 紫杉醇還有類似脂多糖(LPS) 的作用,可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能 生產(chǎn)紫杉醇的方法紅豆杉樹(shù)皮直接提取法化學(xué)半合成法化學(xué)全合成法微生物發(fā)酵法紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)法 目前國(guó)際市場(chǎng)上的紫杉醇主要從紅豆杉樹(shù)皮提取及半合成,迄今為止尚未見(jiàn)有第三種形式形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。紫杉醇

3、是瀕臨滅絕的珍稀樹(shù)種紫杉醇在樹(shù)皮中的含量極低,僅為干重的0.101 %0.106 % ,且生長(zhǎng)緩慢,植株成熟約需100 年。約36棵100 年左右的紅豆杉樹(shù)皮才能提取出用于治療一個(gè)癌癥病人所需求的紫杉醇。即使將世界上現(xiàn)有的紅豆杉全部砍伐，所提取的紫杉醇也只能挽救12.5萬(wàn)癌癥患者的生命，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)今市場(chǎng)的需求量。 現(xiàn)狀：目前98%純度的紫杉醇國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格為每干克40至60萬(wàn)美元，我國(guó)純度為70%的紫杉醇售價(jià)為160至180萬(wàn)元/千克，比黃金價(jià)格還要昂貴。 到目前為止,人們已發(fā)現(xiàn)20 多個(gè)屬的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)紫杉醇 到目前為止,人們已發(fā)現(xiàn)20 多個(gè)屬的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)紫杉醇（表1）,其寄主也不僅

4、限于紅豆杉屬植物, 從非紅豆杉屬植物中也分離到了可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌,充分證明了紫杉醇產(chǎn)生菌及其宿主的生物多樣性。 但目前發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌的產(chǎn)值普遍不高，成為阻礙微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)不利因素。內(nèi)生真菌的分離 標(biāo)準(zhǔn)的真菌分離純化的方法 ：取植物組織，消毒，然后用滅菌的刀片將外層組織削去，將內(nèi)部組織削成小片，小心置入水瓊脂培養(yǎng)基中，待菌絲長(zhǎng)成后，挑取不同菌絲末端置于PDA 培養(yǎng)基中，觀察生長(zhǎng)情況。 平板灌注法 ：用滅菌的刀片去除外皮層和木質(zhì)部，消毒，將紅豆杉樣品加入到適量的無(wú)菌水中，放入研缽中充分研磨，取勻漿注入融化的的PDA 培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，25培養(yǎng)。 分離的關(guān)鍵一

5、步是對(duì)植物組織表面進(jìn)行消毒,以控制表生真菌的生長(zhǎng),使內(nèi)生真菌得以分離。內(nèi)生真菌的培養(yǎng)、保存一般20 25 培養(yǎng)一個(gè)月左右,即可形成內(nèi)生真菌菌落。內(nèi)生真菌一般在PDA或MID培養(yǎng)基中不形成孢子，或者是在滅菌的寄主莖葉中也不形成孢子，但卻可以在康乃馨的葉片上形成孢子。 步驟：取康乃馨葉片經(jīng)過(guò)射線照射滅菌后，置于水瓊脂培養(yǎng)基中，將分離得到的內(nèi)生真菌接種到康乃馨葉片上，23下培養(yǎng)1-2個(gè)星期后，在康乃馨葉片上形成暗色的子實(shí)體結(jié)構(gòu)，對(duì)于真菌的鑒定具有重要的作用。保存：在15%的甘油中-70保存 提高菌種生產(chǎn)力 內(nèi)生真菌紫杉醇的產(chǎn)量本來(lái)就不高，加上脫離植物體后，次生代謝往往停止或延緩，因此，必須用一些方法

6、提高菌種的生產(chǎn)力。一是將從紅豆杉樹(shù)中分離到的紫杉醇生物合成過(guò)程中的限速酶的基因轉(zhuǎn)入到紫杉醇產(chǎn)生菌體內(nèi)，提高關(guān)鍵酶的表達(dá)量，進(jìn)而提高紫杉醇的合成能力。二是從產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌細(xì)胞中分離出產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵酶基因并將其導(dǎo)入微生物體內(nèi)，利用其它真菌甚至細(xì)菌、酵母菌構(gòu)建新的紫杉醇高產(chǎn)工程菌株來(lái)生產(chǎn)紫杉醇。三是優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，通過(guò)添加碳源、氮源和前體物、特殊的誘導(dǎo)子、抑制劑等物質(zhì)借助代謝途徑工程的研究來(lái)提高真菌紫杉醇的合成量。 結(jié)束語(yǔ)目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)還很不成熟，很多內(nèi)生真菌產(chǎn)生紫杉醇的次生代謝途經(jīng)還不是十分清楚，大部分菌株的培養(yǎng)條件還處在摸索階段。另外，由于紫杉醇是一種比較復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，因此，把產(chǎn)生紫杉醇的次生代謝途經(jīng)移接到酵母