Pcr的發(fā)展史課件

1、Pcr的發(fā)展史專業(yè)：作物遺傳育種姓名：李宇峰背景Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想:“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。但由于當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上70年代初分子克隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了。Pcr的原理及反應(yīng)體系原理： DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝

2、。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。反應(yīng)體系Pcr的發(fā)展過程Pcr的實(shí)現(xiàn)：1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。Pcr的改善：（1）Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的K

3、lenow片段，其缺點(diǎn)是：Klenow酶不耐高溫， 90會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。引物鏈延伸反應(yīng)在37下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度 (2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。 樣式不同的pcr儀Pcr的四個(gè)技術(shù)革新第一代：機(jī)械手式水浴箱基因擴(kuò)增三個(gè)水浴箱恒定三個(gè)溫度，94 58 72優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，試驗(yàn)時(shí)間段，更接近pcr理想狀態(tài)。缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，易出錯(cuò)第三代：終點(diǎn)定量?jī)?yōu)點(diǎn)：可以評(píng)價(jià)待定核算的濃度及定量分析第四代：實(shí)時(shí)定量pcr實(shí)時(shí)定量Qpcr儀+實(shí)時(shí)定量試劑+通用電腦+自動(dòng)分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量監(jiān)測(cè)系統(tǒng)研究意義PCR技術(shù)問世以來(lái)正以驚人的速度發(fā)展，不僅其本身不斷地優(yōu)化改進(jìn)，許多新型的PCR技術(shù)或由PCR衍生的新技術(shù)正不斷出現(xiàn)。在PCR技術(shù)的啟發(fā)下，諸如轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、自主序列復(fù)制系統(tǒng)(3SR)、鏈替代擴(kuò)增(SDA)、循環(huán)探針反應(yīng)、等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)等