實驗一兔血清-免疫球蛋白分離與純化課件

1、綜合實驗一 兔血清免疫球蛋白分離與純化 蛋白質(zhì)工程實驗課實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化綜合實驗一 兔血清免疫球蛋白分離與純化 蛋白質(zhì)工程實驗課要求預習不遲到、早退、不曠課、有事請假穿白大褂、注意自我防護不能喧嘩，不做與實驗無關(guān)的事認真完成實驗報告值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、關(guān)燈和門窗實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化實驗課要求預習實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化一、實驗目的二、實驗原理三、實驗儀器及試劑四、實驗步驟五、注意事項六、數(shù)據(jù)處理及計算 實驗一 兔血清免疫球蛋白分離實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化實驗一 兔血清免疫球蛋白分離實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純一 、實驗

2、目的 學習并掌握鹽析法的原理及用鹽析法進行免疫球蛋白分離與純化的技術(shù)。（IgG ）實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化一 、實驗目的 學習并掌握鹽析法的原理及 抗體結(jié)構(gòu) 抗體分子是由兩條輕鏈(light chain, L鏈)和兩條重鏈(heavy chain, H鏈)通過鏈間二硫鍵連接而成。實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化 抗體結(jié)構(gòu) 抗體分子是由兩條輕鏈(li二、實驗原理一 鹽析 當用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱甚至消失；同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子

3、之間聚集而沉淀，這個過程叫做鹽析。實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化二、實驗原理一 鹽析 當用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對實驗原理-鹽析不同蛋白質(zhì)由于所帶電荷不同以及水化程度不同，加入不同濃度的中性鹽可分階段從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)鹽析中最常用的鹽是硫酸銨硫酸銨分級沉淀實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化實驗原理-鹽析不同蛋白質(zhì)由于所帶電荷不同以及水化程度不同，加三、 實驗儀器及試劑1. 實驗材料：血清（兔免疫血清）。2. 試劑：0.01mol/LpH7.4 PBS、0.5 mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、飽和硫酸按（用前以5mol/ L NaOH調(diào)至pH7.4）、奈氏試劑。實

4、驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化三、 實驗儀器及試劑1. 實驗材料：血清（兔免疫血清）。實驗三、 實驗儀器及試劑3. 用具：三角瓶、燒杯、各種吸管、小試管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或雙蒸水煮沸10min）、飯盒（裝碎冰）等。4. 儀器：攪拌器、離心機等。5. 溶液配制實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化三、 實驗儀器及試劑3. 用具：三角瓶、燒杯、各種吸管、小試三、實驗試劑飽和硫酸銨溶液的配制： 稱（NH4）2SO4400425克，以7080之蒸餾水500ml溶解，攪拌20分鐘，趁熱過濾。冷卻后以濃氨水（28%氨溶液）調(diào)PH至7.4。配制好的飽和硫酸銨，瓶底應有結(jié)晶析出。 實驗一兔血

5、清 免疫球蛋白分離與純化三、實驗試劑飽和硫酸銨溶液的配制：實驗一兔血清 免疫球蛋白分磷酸鹽緩沖液0.2M，PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制。貯存液：A液： 0.2M NaH2PO4：NaH2PO42H2O 31.2克，加蒸餾水至1000ml；B液： 0.2M Na2HPO4：Na2HPO412H2O 71.7克，加蒸餾水至1000ml； 應用液：取A液19ml加B液81ml混合，再以生理鹽水作10倍稀釋，加入NaCl至終濃度為0.85%，即為PBS。 實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化磷酸鹽緩沖液0.2M，PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液（Ph

6、osph柰氏試劑HgI 11.5g，KI 8.0g，加雙蒸水至50ml；攪拌溶解后過濾，濾液中再加入濃度為20%的溶液NaOH 50ml。實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化柰氏試劑HgI 11.5g，KI 8.0g，加雙蒸水至50m四、實驗步驟1 兔免疫血清的制備實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化四、實驗步驟1 兔免疫血清的制備實驗一兔血清 免疫球蛋白分離2 硫酸銨分級沉淀（1）取制備好的血清20ml，逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液20ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置10min。（2）3000r/min離心10min，棄去上清。（3）用6ml磷酸鹽緩沖液

7、溶解沉淀，再加（NH4）2SO4飽和溶液3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置10min。（4）3000r/min離心10min，棄上清。（5）為進一步純化，可重復步驟3 23次。實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化2 硫酸銨分級沉淀（1）取制備好的血清20ml，逐滴加入（3 透析去鹽（6）用5mlPBS溶解沉淀，裝入透析袋。（7）透析除鹽，中間換液數(shù)次，至奈氏試劑測透析外液無黃色。 實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化3 透析去鹽（6）用5mlPBS溶解沉淀，裝入透析袋。實驗一五、數(shù)據(jù)處理及計算蛋白含量（mg /mL）（1. 45OD 280nm 0. 74 OD 260nm） 樣品稀釋度 注：式中1.45與0.74為常數(shù)，nm為波長。蛋白質(zhì)及其定量鑒定：取樣品少許作適量稀釋，以紫外分光光度計測量蛋白含量 260、280nm處讀數(shù)實驗一兔血清 免疫球蛋白分離與純化五、數(shù)據(jù)處理及計算蛋白含量（mg /mL）蛋白質(zhì)及其定量鑒實驗報告的要求題目、原理、主要試劑與器材、步驟、結(jié)果、注意事項（心得體會）班級、姓名、學號由學習委員統(tǒng)一收齊，按學號從小到大順序放好自己寫、書寫整齊訂成一本或每次分開實驗一兔血清