RT-PCR反轉(zhuǎn)錄原理及方法課件

1、RT-PCR原理及方法09-10-15背景基因的表達(dá)基因組DNA (genomic DNA)信使RNA (messenger RNA, mRNA)蛋白質(zhì)產(chǎn)物不同細(xì)胞或組織表達(dá)不同的基因目的通過(guò)反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的方法，檢測(cè)目的基因在特定組織或細(xì)胞中、mRNA水平的表達(dá)豐度。原理及方法mRNA (messenger RNA)cDNA (complementary DNA) PCR產(chǎn)物RT(反轉(zhuǎn)錄) PCR(聚合酶鏈反應(yīng))原理及方法步驟1-提取總RNATRIzol法抽提總RNA 1、

2、細(xì)胞1107 或組織100mg,加1mlTRIzol (細(xì)胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊勻漿要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管） 顛倒混勻10下，室溫5分鐘。 2、氯仿1/5體積（0.2ml），顛倒混勻10下，室溫5分鐘。 3、4，離心12000g，15分鐘。 4、轉(zhuǎn)上層水相（約400l）于另一1.5mlEP管中，加等體積異丙醇（約400l），混勻室溫10分鐘。 5、4，離心12000g，10分鐘。 6、棄上清，加冰預(yù)冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。 7、4離心7500g，5分鐘。 8、棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20l（可在55-60水中，10分鐘助溶

3、）。 9、紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA濃度。 步驟2反轉(zhuǎn)錄(RT)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： 1、試劑 濃度 體積 終濃度 RNA 23l(11.5l) Oligo(dT)15 0.05g/l 4l(2l) 0.005g/l 混勻，離心，70 5min。 2、立即冰水浴，稍離心 試劑 濃度 體積 終濃度 M-MLV Buffer 5 8l (4l) 1 dNTP 10mM 2l (1l) 0.5mM RNasin 40U/l 1l (0.5l) 20 M-MLV 200U/l 2l (1l) 200U 總體積40l（20l）混勻，離心，42 60-90min。 3、95 10min（破壞MLV），4保存。 步驟

4、4瓊脂糖凝膠電泳加1-10l PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液（1-2.5l）混勻，加樣，電泳。所需材料及試劑一、實(shí)驗(yàn)器具與材料： 1、移液槍：1ml、200l、20l、10l、2l 2、吸頭：1ml、200l、20l 3、勻漿管：5ml 4、吸頭臺(tái)：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置20l吸頭的一個(gè) 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100l 6、試劑瓶：2個(gè)60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋） 1個(gè)125ml的白色試劑瓶（放無(wú)水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、試管架：5ml、1.5ml、20l 10、鹽水瓶：250ml、500ml各2

5、個(gè)備用，一個(gè)裝無(wú)水乙醇，另一個(gè)裝DEPC水 11、鋁制飯盒：4個(gè) 12、塑料小飯盒：1個(gè) 13、大瓷缸：2個(gè) 14、錫泊紙：一卷 15、卷紙：2卷 16、三角燒瓶：帶蓋，稍大 所需材料及試劑二、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備 1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等） 先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過(guò)夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再高壓一次 2、玻璃制品：泡酸過(guò)夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1DEPC過(guò)夜，再高壓） 3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高溫干烤所需材料及試劑四、幾種緩沖

6、液的配制： 1、電泳緩沖液： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml？ pH8.0 蒸溜水 1000ml 5TBE （貯存液） 再將5TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時(shí)使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液+450ml水-500ml工作緩沖液 2、上樣緩沖液： 0.25%溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6緩沖液，4保存 所需材料及試劑五、瓊脂糖凝膠的配制： 1、1.0%： 1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60時(shí)加入10mg/ml溴化乙錠(Golden View) 5l，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已

7、置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后進(jìn)行電泳。 2、1.5%: 同上，將瓊脂糖的量改為1.5g(分辨率要求高時(shí)使用) 所需材料及試劑七、引物合成 1、-actin: 正義：5-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3 反義：5-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3 2、par-4: 正義：5-GGGACCTCGGAACTCAAC-3 反義：5-TGTATCTGCCTGGGACTG-3 3、退火溫度計(jì)算 2（A+T）+4（G+C） 正反義平均數(shù)，再上下波動(dòng)度（4，或5） 4、引物各合成5OD，每OD一瓶分裝好 5、引物稀釋： 加DEPC水量為（l） = ? nmol / OD 管上所標(biāo)OD數(shù)100 是為10pmol / l 濃度的引物溶液 所需材料及試劑八、PCR產(chǎn)物電泳 先將1-10l左右PCR產(chǎn)物，加已點(diǎn)在紙上的溴酚蘭上樣緩沖液，反