大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜及其產ESBLs的研究

1、大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜及其產ESBLs的研究陳云波王震查長森鄒立林季敬章彭穎呂建新【摘要】目的理解臨床別離的54株大腸埃希菌對氨基糖類苷類抗生素的耐藥譜及產ESBLs情況，分析氨基糖苷類修飾酶AA(3)-II的檢出率及該酶的一些特征。方法采用I法測定臨床別離的54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的耐藥譜，用NLS推薦的酶抑制劑增強紙片擴散法檢測產ESBLs菌株，并通過聚合酶鏈反響、克隆測序和測定重組菌耐藥譜對aa(3)-II基因進展研究。結果54株大腸埃希菌對阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素、大觀霉素和奈替米星的耐藥率分別為14.8%、77.8%、59.3%、66

2、.7%、68.5%、61.1%、22.2%；共檢測出產ESBLs菌株34株，占63.0%；aa(3)-II基因在54株大腸埃希菌中檢出率為88.5%；質粒轉化菌產ESBLs且同時檢出aa(3)-II基因。重組菌BL21(DE3)/pET26：aa(3)-II對慶大霉素和卡那霉素有耐藥性，對其余5種氨基糖苷類抗生素沒有表現(xiàn)出耐藥性。結論大腸埃希菌對慶大霉素的耐藥率最高，對阿米卡星的耐藥率最低；耐氨基糖苷類抗生素的大腸埃希菌與其產ESBLs有相關性；重組菌BL21(DE3)/pET26：aa(3)-II僅對慶大霉素和卡那霉素產生耐藥?！娟P鍵詞】大腸埃希菌；氨基糖苷類抗生素；修飾酶；超廣譜內酰胺酶；

3、耐藥性ResearhnainglysideresistaneprfilesandprduingESBLsABSTRATbjetiveTinvestigatetheainglysideresistaneprfilesandprduingESBLsflinialEsherihialistrainsandanalyzetheharateristifAA(3)-II.ethdsItestsf7ainglysidesandESBLsnfiratintestsereperfred54strainsfE.liaa(3)-IIgeneasaplifiedbyPRandlnedintpET26b,thenand

4、sequened.AtivityfAA(3)-IIastestedbyIethd.ResultsTheresistantratesf54strainsfE.litaikain,gentaiin,kanayin,tbrayin,streptyin,spetinyin,netiliinere14.8%,77.8%,59.3%,66.7%,68.5%,61.1%,22.2%and63.0%(34/54)fstrainserefundprduingESBLs.Thepsitiveratefaa(3)-IIgeneas88.5%(45/54).Theaa(3)-IIgeneresistanetgenta

5、iinandkanayin,butntther5ainglysides.nlusinsFifty-furstrainsfE.lihadthehighestresistantratetgentaiinhilehadthelestresistantratetaikain.ESBLs-prduingstrainserestlyinainglyside-resistaneE.li.Theaa(3)-IIgenenlyediatesresistanetgentaiinandkanayin.KEYRDSEsherihiali;Ainglysides;difyingenzyes;Extended-spetr

6、ubeta-lataases;Antibitiresistane大腸埃希菌(E.li)是條件致病菌，2002年全國細菌耐藥性監(jiān)測網對所屬57家三級甲等醫(yī)院的調查發(fā)現(xiàn)，其臨床別離率列第一位(14.2%)1。目前國內對大腸埃希菌的多重耐藥性已引起很大的重視，對-內酰胺類、氨基糖苷類抗生素(ainglysides)的耐藥機制有較多的研究，但兩者相關性的研究還不多。以54株從臨床別離的大腸埃希菌為研究對象，測定菌株對7種氨基糖苷類抗生素的最低抑菌濃度(I)及檢測其產超廣譜-內酰胺酶(ESBLs)，為臨床合理有效地應用抗生素提供根據；同時克隆aa(3)-II基因到pET26b，檢測重組菌BL21(DE3

7、)/pET26：aa(3)-II對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜，為進一步研究aa(3)-II基因奠定基矗1材料和方法1.1實驗菌株及質粒搜集從2022年28月溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床送檢的血液、腹水、尿液等無菌體液標本別離得到的大腸埃希菌，紙片法測定其對慶大霉素(gentaiin，抑菌圈直徑12)、卡那霉素(kanayin，抑菌圈直徑13)和妥布霉素(tbrayin，抑菌圈直徑12)任一或以上耐藥菌共54株，其中已剔除重復菌株，細菌標記為YD加四位流水號(如YD1094、YD1102)。細菌的別離鑒定及藥敏試驗參照全國臨床檢驗操作規(guī)程進展，并經法國Bi-erieux公司VITEK60細菌鑒定儀鑒

8、定。質控的標準菌株為大腸埃希菌AT25922和肺炎克雷伯菌AT700603，宿主菌為BL21(DE3)，pET26b為表達載體，以上菌株及質粒均由本實驗室保存。1.2體外最低抑菌濃度的測定采用瓊脂稀釋法測定阿米卡星(aikainA)、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素(kanayin)、奈替米星(netiliin)、大觀霉素(spetinyin)、鏈霉素(streptyin)對54株大腸埃希菌的I，以大腸埃希菌AT25922為質控菌株，按LSI/NLS(2022)版解釋實驗結果2。1.3超廣譜-內酰胺酶(ESBLs)的檢測ESBLs的檢測采用NLS推薦的酶抑制劑增強紙片擴散法。頭孢噻肟(TX)、頭孢

9、他啶(AZ)、頭孢噻肟/克拉維酸(D3)、頭孢他啶/克拉維酸(D2)紙片為英國xid公司產品。單藥紙片(TX、AZ)與相應的含酶抑制劑紙片(D3、D2)中任何一對的抑菌環(huán)直徑之差5為產ESBLs菌株。以大腸埃希菌AT25922為陰性對照株，肺炎克雷伯菌AT700603為陽性對照株。1.4質粒的提取及轉化用質粒提取試劑盒提取臨床別離菌株YD1094、YD1102的質粒，并轉化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)，涂布于含慶大霉素(8g/l)的LB固體培養(yǎng)基中，挑取生長的單個菌落，并分別記作為BL21/YD1094，BL21/YD1102。提取轉化菌的質粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳。按“1.2及“1.3方

10、法，對上述兩株轉化菌對7種氨基糖苷類抗生素的I及產ESBLs的檢測。1.5氨基糖苷類修飾酶基因aa(3)-II的檢測自行設計aa(3)-II基因引物，并在引物上添加酶切位點，上游引物5-GGATATGATFATAG-GGAAGGAAT-3(下劃線處為NdEi酶切位點)，下游引物5-TTTGAGTAAGG-AAGGTGAGG-3(下劃線處為XhI酶切位點)，PR產物長度為877bp。采用堿裂解法提取細菌質粒DNA。50l的PR反響體系中包括：10反響緩沖液5l、5/Lg123l、2.5l/L的4種dNTPsix4l、引物(20l/L)各2l、TaqDNA聚合酶2.5U和模板2.5l。PR反響條件

11、：94預變性5in；30個循環(huán)為94變性1in56退火1in72延伸1in；最后延伸10in。1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PR結果。陽性PR產物經純化后送TAKARA公司雙向測通，序列在GenBank上比對。1.6aa(3)-II基因的克隆及重組菌的耐藥譜選取一份PR陽性產物經純化回收，NdeI和XhI雙酶切后與經一樣雙酶切后的表達載體pET26b連接；連接產物轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞并涂布到含卡那霉素25g/l的LB固體培養(yǎng)基中；挑取生長的單個菌落，經PR和NdeI-XhI雙酶切證實為重組菌BL21(DE3)/pET26：aa(3)-II；采用瓊脂稀釋法測定上7種氨基糖苷類抗生素的I

12、，同時以BL21(DE3)和BL21(DE3)/pET26b為對照，大腸埃希菌AT25922為質控菌株，結果解釋同前。2結果2.1大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的I紙片法示54株大腸埃希菌對慶大霉素、卡那霉素和妥布霉素其中一種或以上耐藥。54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的I結果如表1所示。2.2大腸埃希菌對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素的耐藥表型及產ESBLs的檢測結果54株大腸埃希菌對三種氨基糖苷類抗生素的耐藥表型如表2所示。用NLS推薦的ESBLs表型確證法檢測到34株陽性菌株，占63.0%。表154株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素表254株大腸埃希菌對三氨基糖苷類抗生素的2.3臨

13、床別離菌的質粒轉化菌結果2株轉化菌的質粒經提娶電泳后均示一條條帶；對氨基糖苷類抗生素的I如表3所示；同時均產ESBLs。2.4aa(3)-II基因的PR及測序結果在54株大腸埃希菌中共檢測出PR陽性45株(占83.3%)；陽性產物均經測序并在GenBank與已登錄的序列作比對，結果一致。2.5aa(3)-II基因的克隆及重組菌的耐藥譜結果重組菌經PR和雙酶切后證實，aa(3)-II基因成功克隆并轉化，重組菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥結果如表3所示。表32株質粒轉化菌及重組菌對7種氨基糖苷類抗生素的I(g/l)3討論(1)氨基糖苷類抗生素是一類由氨基環(huán)醇、氨基糖與糖組成的抗生素的總稱，包括慶大霉素

14、、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素等。氨基糖苷類抗生素依賴電子轉運，通過細菌內膜到達胞質中，與核糖體30S亞基結合。雖然這種結合并不阻止起始復合物的形成，但能通過破壞控制翻譯準確性的校讀過程來干擾新生鏈的延長，導致細菌的死亡3。由于氨基糖苷類抗生素在臨床上和動物細菌性疾病的預防與治療中長期和不合理的應用，使細菌對其耐藥性顯得日益突出。在本研究中，從臨床別離的大腸埃希菌對慶大霉素的耐藥率最高，到達77.8%，其次為妥布霉素(66.7%)和卡那霉素(59.3%)，對阿米卡星的耐藥率最低(14.8%)，這可能與阿米卡星是經過構造改造、能抵抗氨基糖苷修飾酶的半合成氨基糖苷類抗生素有關3。本研究結果與姚蕾等4

15、報道的2022年北京地區(qū)大腸埃希菌耐氨基糖苷類抗生素的結果根本相似，但卡那霉素的耐藥率比姚蕾等報道的高(北京地區(qū)為40.6%)，這可能與不同地區(qū)有不同的用藥習慣有關。大腸埃希菌對奈替米星的耐藥只有22.2%，但對其中度敏感的比率卻達50.0%，這可能是因為奈替米星作為第三代氨基糖苷類抗生素在構造上作了改良，使得AA(3)-II對奈替米星的修飾作用受到局部限制但不能完全排除影響3。54株大腸埃希菌中有8株細菌對阿米卡星耐藥，其中有7株為高程度耐藥(I512g/l)且對其他6種氨基糖苷類抗生素也有較高程度的I值(均I128g/l)，顯然，這種對幾乎所有氨基糖苷類抗生素高程度的耐藥現(xiàn)象可能存在有多種

16、耐藥機制或高程度耐藥機制，如16SrRNA甲基化酶5。(2)超廣譜-內酰胺酶(ESBLs)是指由質粒介導的能賦予細菌對頭孢菌素類、氨曲南以及青霉素類廣泛耐藥的一類酶。有學者認為6，以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗生素對細菌所產的大局部-內酰胺酶穩(wěn)定，氨基糖苷類抗生素對這一類細菌亦然，特別是對阿米卡星耐藥率在20%。在治療由產ESBLs大腸埃希菌感染時可以采用氨基糖苷類抗生素加頭霉烯類抗生素，或氨基糖苷類抗生素加-內酰胺酶抑制劑類抗生素結合用藥方案。段建春等報道7，在產ESBLs的大腸埃希菌中aa(3)-II基因的檢出率高達80%。在本研究中，共有34株細菌產ESBLs，其中有30株為aa(3)-

17、II基因陽性，占88.2%；在45株aa(3)-II基因陽性的細菌中，有30株產ESBLs(占66.7%)，這個比例比一般的大腸埃希菌中產ESBLs檢出率高8。將臨床別離菌的質粒轉化到BL21中，提取質粒并電泳后示僅單一條帶；同時檢測到aa(3)-II基因和產ESBLs，說明這兩種基因在同一個質粒上。Pattersn等9認為氨基糖苷類修飾酶基因與ESBLs基因可在同整合子上，表現(xiàn)出多重耐藥。由于在本實驗中沒有作整合子的檢測，所以不能認為它們在同一整合子上，但可以認為這兩個基因很可能會同時隨著質粒而傳播耐藥性。因此在治療產ESBLs的大腸埃希菌時，應考慮其可能同時攜帶有aa(3)-II基因或其他

18、氨基糖苷修飾酶基因，防止使用此類抗生素。(3)到目前為止，細菌對氨基糖苷類抗生素產生耐藥的分子機制主要有以下五種：細菌產生一種或多種修飾酶，使進入細菌胞內的抗生素失去生物活性；抗生素作用靶位的改變、核糖體堿基發(fā)生變化或與核糖體結合的核蛋白氨基酸發(fā)生突變，使抗菌藥物無法發(fā)揮作用；細菌細胞膜通透性改變，使進入胞內的抗菌藥物減少；細菌通過主動外排(ativeefflux)機制將已進入胞內的藥物泵至胞外；細菌產生16SrRNA甲基化酶。細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥主要是由于產生了一種或多種氨基糖苷類修飾酶(AEs)。AEs分為三大類，即乙酰轉移酶(AA)、核苷轉移酶(ANT)和磷酸轉移酶(APH)。此類

19、酶作用于氨基糖苷類抗生素特定的氨基或羥基，使抗生素發(fā)生鈍化，使其降低或喪失對靶位核糖體的親和力10。產AA(3)-II是大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素耐藥中最常見的耐藥機制之一4。在本研究的54株對氨基糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌中，aa(3)-II基因的檢出率為83.3%(45/54)。根據氨基糖苷類抗生素的耐藥性分為三種耐藥表型(表2)：G-T型、G型和G-T-A型，其中G-T型占多數(shù)且全部檢出aa(3)-II基因，這與孔海深等11報道的結果相類似。這種耐藥表型與基因型并不完全一致的原因可能是由于氨基糖苷類修飾酶基因多數(shù)由整合子介導，且一個整合子可攜帶多個修飾酶基因12；耐藥基因盒的表達不僅

20、依賴于啟動子的強弱，而且與啟動子的間隔 遠近有關：上游基因表達強，下游基因表達弱甚至不表達13。6株對慶大霉素敏感且檢出aa(3)-II基因的大腸埃希菌的藥敏結果顯示，這6株對奈替米星、卡那霉素、鏈霉素、大觀霉素、阿米卡星和妥布霉素中的一種或多種耐藥。有學者3認為aa(3)-II基因可以以沉默狀態(tài)存在，表現(xiàn)為不耐藥；同時修飾酶在細胞內的定位也可能使有該酶基因的檢出但不表現(xiàn)為耐藥；而對奈替米星和妥布霉素等AA(3)-II底物的耐藥可能是由于這些菌株中存在的其他耐藥機制所致，如產AA(6)-I。(4)在本研究中，成功地克隆了一株aa(3)-II基因的重組菌BL21/pE26b：aa(3)-II。重

21、組菌的藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，重組菌對慶大霉素和卡那霉素有耐藥性，對奈替米星和妥布霉素以及其他氨基糖苷類抗生素沒有產生耐藥性。這可能是aa(3)-II基因在重組狀態(tài)下所產生的重組蛋白在蛋白的正確折疊、二硫鍵形成與天然蛋白質有一定的差異，使酶的活性發(fā)生了改變。由于慶大霉素的構造較妥布霉素等簡單，其I環(huán)3位氨基處于沒有其他空間阻隔的狀態(tài)，易被修飾酶所攻擊3；同時如今也有學者認為妥布霉素與核糖體結合的部位不止一個，妥布霉素可以以對稱或不對稱的方式二聚體化后以擴大范圍，這樣減少修飾酶對妥布霉素的修飾作用而發(fā)揮抗菌才能14。綜上，大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜中，對慶大霉素的耐藥率最高(77.8%)，對阿米

22、卡星最低(14.8%)。在對氨基糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌中，ESBLs的檢出率較高(63.0%)，為臨床上合理選擇和使用抗生素提供實驗根據?！緟⒖嘉墨I】1馬越，李景云，張新妹，等.2002年臨床常見細菌耐藥性監(jiān)測J.中華檢驗醫(yī)學雜志，2022，27(1)：3845.2iklerA,kerillFR,raigA,etal.Perfranestandardsfrantiirbialdisksuseptibilitytests;telfthinfratinalsuppleentS.NLS,2022,24,100-S14.3ingit-LelerqP,GlupzynskiY,TulkensP.Ai

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