總RNA的提取-電泳鑒定及RT-PCR課件

1、實驗二、 RNA提取及RT-PCR實驗內(nèi)容1、小鼠肝臟組織總RNA的提取2、RNA的瓊脂糖凝膠電泳3、以RNA為模板進行RT-PCR4、 PCR產(chǎn)物的電泳及回收實驗一. 提取小鼠肝臟組織的RNA一、真核細胞的總RNA 1、mRNA: 1-5% 5鳥嘌呤7位甲基化CH3修飾。 1）免受核酸酶破壞， 2）起始、促進蛋白質(zhì)合成。 3poly(A)尾巴結(jié)構(gòu) 20-200個A. 翻譯所必需。 起始密碼：AUG 終止密碼：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亞基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亞基40S: 18S

2、=1874nt二、RNA提取的注意事項 RNA酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實驗器材表面。 生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。 1、 盡量避免外源性RNase 污染 A. 操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。 B. 用新開封的化學試劑。（試劑應(yīng)該專用） C. 一次性塑料器材最好是新開封， (DEPC水處理后）高壓滅菌。 D. 玻璃器材、水都應(yīng)該經(jīng)過去RNase 處理。 對玻璃器材還應(yīng)該進行高溫烘烤。 2、抑制內(nèi)源性RNase 活性： RNase 抑制劑。 RNA分離的關(guān)鍵因素：避免RNA酶的污染。1、異硫氰酸胍法： GuSCN 是一種強的蛋白質(zhì)變性劑，能夠裂解細胞的同時，還能有效地抑制內(nèi)源性 R

3、nase的活性，通過有機溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細胞總RNA。 特點：需低溫操作，但價格經(jīng)濟。2、Trizol 試劑（商品化產(chǎn)品） 特點：在室溫下可以提取細胞總RNA， 簡單、快速、提取量大、純度高。3、mRNA提取試劑盒 真核細胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纖維素結(jié)合mRNA，將其從細胞總RNA中分離出來。RNA提取的幾種方法室溫孵育10 min介紹RNase抑制劑1、DEPC ( 二乙基焦炭酸鹽) 最常用的RNase抑制劑: 與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合， 使蛋白質(zhì)變性。 有效濃度：0.05%-0.1%(DEPC水)，室溫磁力攪拌20分鐘。用于浸泡各種器材。滅活條件

4、：高壓。 在Tris溶液中半衰期為1.25min。 試劑的配制:無RNase的溶液(用DEPC水配制, 高壓) 儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。2、肝素： 使用濃度：0.110mg/ml 效 果: 37 C 時，可抑制95%的RNase 活力。 如果與DEPC聯(lián)合應(yīng)用， 具有極強的抑制效果。8) 沉淀RNA： 加0.5 ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫10 min。 10, 000rpm，4C，離心10 min棄上清。) 加1ml 75%乙醇洗滌管壁。 (注意貼管壁在沉淀的對側(cè)緩慢加入，不要攪動沉淀)10) 7500rpm，4C 離心 1 min，棄上清 再離心幾秒鐘， 將管壁

5、液體（用加樣器）完全移凈。用TriZol試劑提取總RNA時，全程均在室溫進行。當RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在冰上操作，操作要迅速。11)室溫干燥35 min （根據(jù)RNA沉淀大小決定，干燥后的沉淀應(yīng)該是無色膠樣透明狀，避免過分干燥,此步驟非常關(guān)鍵。）注意事項：RNA:避免放在37 C孵箱中過度干燥以防無法溶解。RNA沉淀必須絕對干燥，微量乙醇殘留，容易造成RT的失敗，但過分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RNA pellet：透明膠樣干燥后應(yīng)該無色透明12） RNA的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 l

6、，加到RNA上，進行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA應(yīng)置冰上保存。13) 吸出 4.5 l溶液放到冰上備用(將用于電泳).14) 剩余 9 l溶液,放到冰上備用（將用于RTPCR）.注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加樣器反復(fù)多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體判斷溶解程度：吹打時液體流動不拐彎為止。 基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點的是，因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RN

7、A酶對樣品的降解RNA 的瓊脂糖凝膠電泳 RNA樣品： 4.5 l 上樣緩沖液： 1 l 混勻后， 5.5 l 直接電泳上樣（100伏，1030分鐘） 上樣前預(yù)電泳5min。 注意: 電泳槽的清潔！所有試劑、器材、溶液需要滅RNA酶處理。 瓊脂糖凝膠要新鮮配制！ 紫外透射儀觀察電泳結(jié)果RNA的電泳上樣： 分析本次實驗結(jié)果：28S、 18S和5S的比例。RNA電泳結(jié)果分析實驗三：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR（RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄酶： 存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)。 常見有哺乳動物型37oC，禽類型42oC 。 以mRNA為模板的DNA聚合酶，形成與RNA堿基相互補DNA鏈，后者稱為互補DNAcDNA。 RNAas

8、eH的活性：切掉DNA和RNA雜合鏈上的RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h 逆轉(zhuǎn)錄有聲課件3: RT 的原理和注意事項 總RNA 9 l Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (終：2.5 ng/ml) 輕彈管底混合， 置65水浴10min， 立即冰浴2min（防止RNA形成二級結(jié)構(gòu)）。第一步：打開RNA鏈之間的二級結(jié)構(gòu)，使Oligo dT 特異性地結(jié)合到 PolyA 尾。

9、 5RT-buffer 4 l RNasin (RNA酶抑制劑，40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV （逆轉(zhuǎn)錄酶） 1 l 輕彈管底混合。置42 oC 水浴1h。第二步：向上述反應(yīng)溶液中依次加入下列試劑第三步：將上述反應(yīng)移至68 oC水浴10min以滅活 RTase，并冰浴，保存?zhèn)溆梦?休1）模板DNA (上次課逆轉(zhuǎn)錄的cDNA） 4 l2）加入下列試劑,，順序可以改變 10X PCR buffer (含MgCl2 ) 5 l dNTPs (10mM) 1 l 3 引物 (10mol/L) 1 l 5 引物 (10mol/L) 1 l 3）加去離子水 ，補足

10、50l最終反應(yīng)體系4）Taq DNA 聚合酶(2U/l) 1 l實驗操作一、建立 PCR 反應(yīng)體系3. 輕彈管底混勻，然后放入離心機的套管內(nèi)，用離心機甩一下；4. 將PCR小管交給老師，老師統(tǒng)一將樣品放入PCR儀。取 1 支200 l 微量離心管（在第一組同學的實驗臺上方的平皿里）中，用 Marker 筆 在管的側(cè)面 標記；2. 依次加入下列試劑：注意：（1） PCR相關(guān)試劑均放在每排實驗臺上方中間位置處的藍色 圓盒中 （2）加樣的體積要準確，1 l 的體積不應(yīng)該超過白色槍頭的第一個格。 播放：有聲課件 （PCR講解1）播放：有聲課件 （PCR講解2）播放：PCR 動畫實驗操作 三、 PCR產(chǎn)

11、物的電泳1. 教師指導(dǎo)學生將瓊脂糖凝膠（1%）放入膠床上。2. 樣品制備： 在50 l PCR產(chǎn)物中，加入 6 ul 上樣液，混勻。 （上樣液：10Loading buffer 或 6Loading buffer） 3. 上樣： 將上述樣品加入凝膠加樣孔中。 注意：DNA Marker。4. 電泳：100 伏，30分鐘。操作四、PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果觀察及分析GAPDH gene 片段 (746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker 1 2（2）此PCR 結(jié)果存在什么問題？原因？你擬采用哪些措施解決上述問題？（1）觀察： 藍色箭頭指示的是何種DNA ？GAPDH gene 片段 (746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker 1 2擠膠法回收PCR產(chǎn)物：（1）在UV燈下，用手術(shù)刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放入封口膜中； （2）將切下來的膠塊，標記好