流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用培訓(xùn)課件

1、流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用二、流式免疫學(xué)染色方法免疫樣品的制備要求：1.一定數(shù)量的單細(xì)胞懸液，這是流式測(cè)定的基礎(chǔ)，如果懸液細(xì)胞數(shù)量過(guò)少，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性可能會(huì)受到影響2.死細(xì)胞和碎片在某些免疫熒光樣品測(cè)定中，有可能干擾免疫熒光的分布，應(yīng)予以排除，以免引起測(cè)定結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用2二、流式免疫學(xué)染色方法免疫樣品的制備要求：流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)免疫樣品的制備要求：3.熒光素所發(fā)熒光的強(qiáng)度與結(jié)合位點(diǎn)多少應(yīng)成正比，在通常情況下，流式免疫樣品的制備采用直接或間接免疫標(biāo)記法二、流式免疫學(xué)染色方法流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用3免疫樣品的制備要求：3.熒光素所發(fā)熒光的強(qiáng)

2、度與結(jié)合位點(diǎn)多少應(yīng)二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：取與熒光素交聯(lián)的抗體直接加入一定量的細(xì)胞(約1l06細(xì)胞/ml) 懸液中，進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)。如做雙參數(shù)標(biāo)記染色，可把兩種分別標(biāo)有不同熒光素的抗體同時(shí)加入流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用4二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：取與熒光素交聯(lián)的抗二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用5二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：2 標(biāo)記反應(yīng)一定時(shí)間后，用PBS液(pH7.2-7.4)洗滌細(xì)胞懸液兩次，離心后重新懸浮于緩沖液中，上機(jī)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用

3、6二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：2 標(biāo)記反應(yīng)一二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：優(yōu)點(diǎn)： 所測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，陰陽(yáng)性結(jié)果易分析，適用于同一細(xì)胞群體多種參量標(biāo)記的測(cè)定流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用7二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：優(yōu)點(diǎn)：流式細(xì)胞術(shù)在二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：缺點(diǎn)： 在檢查每一抗原時(shí)都要制備與抗原相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，不但熒光抗體制備復(fù)雜，而且費(fèi)用昂貴，另外其敏感性也較間接法稍差流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用8二、流式免疫學(xué)染色方法直接免疫熒光標(biāo)記法：缺點(diǎn)：流式細(xì)胞術(shù)在二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)記法： 取一定量的細(xì)胞或細(xì)胞核懸液約 1x1

4、06 細(xì)胞 /ml 加入特異的第一抗體，待結(jié)合反應(yīng)一定時(shí)間后，洗去多余的抗體，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，形成一種抗原抗體抗抗體免疫復(fù)合物，通過(guò)FCM檢測(cè)其熒光流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用9二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)記法： 取一二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)記法：流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用10二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)記法：流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)記法：優(yōu)點(diǎn)： 操作較簡(jiǎn)單，費(fèi)用較低，只要制備相關(guān)的第一抗體，二抗可較廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用11二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)記法：優(yōu)點(diǎn)：流式細(xì)胞術(shù)在二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)

5、記法：缺點(diǎn)： 由于二抗常為多克隆抗體， 非特異性熒光背景較強(qiáng)，非特異性結(jié)合較多，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，因此，在樣品制備的同時(shí)應(yīng)增設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照，避免測(cè)定結(jié)果的假陽(yáng)性，另外，由于間接免疫熒光標(biāo)記步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用12二、流式免疫學(xué)染色方法間接免疫熒光標(biāo)記法：缺點(diǎn)：流式細(xì)胞術(shù)在三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分： 在制備好的單細(xì)胞懸液中，常含有不同大小、形 狀 的 細(xì) 胞 群 ， 對(duì)于不同的細(xì)胞群， 常用90光散射和前向角散射區(qū)分其體積大小，然后可以通過(guò)計(jì)算機(jī)畫(huà)出地形圖，等高線圖或點(diǎn)陣圖，畫(huà)出不同細(xì)胞群的范圍，選擇有用的細(xì)胞群體流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用1

6、3三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分：流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用14三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分：流式細(xì)胞術(shù)三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分： 這種區(qū)分細(xì)胞群體的方法簡(jiǎn)便。然而，固定劑固定后的細(xì)胞可能會(huì)改變某些細(xì)胞的光散射的特性，在區(qū)分細(xì)胞群體時(shí)應(yīng)加以考慮。常用的另一種區(qū)分細(xì)胞的方法是利用某些染料對(duì)死活細(xì)胞膜的穿透性不同，核著色與否這些特點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用15三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分： 如PI染料染色培養(yǎng)

7、后的細(xì)胞，死細(xì)胞內(nèi)有PI染料發(fā)出較強(qiáng)的熒光，而活細(xì)胞由于膜的選擇性通透，阻擋了PI染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此所發(fā)出的熒光很弱流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用16三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)混合細(xì)胞群體的區(qū)分： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料常用的免疫熒光染料有：異硫氰熒光素 (FITC)藻膽蛋白類染料 藻紅蛋白(PE) 藻青蛋白 別藻紅蛋白德州紅(Texas Red)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用17三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料常用的免疫熒光染料三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料： 這幾種染料都能與純化的單克隆抗體結(jié)合，可以在較廣范的波長(zhǎng)范圍內(nèi)被有效地激發(fā)，其發(fā)射光容易被區(qū)分，

8、分別為紅、綠橙色流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用18三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料： 用兩種染料結(jié)合兩種不同的抗體， 每一種細(xì)胞結(jié)合抗體的熒光都是不同的，用不同的探測(cè)器測(cè)定不同的發(fā)射波長(zhǎng)，這樣可以同時(shí)檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞的兩個(gè)參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用19三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料： 用三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料： FITC和PE兩種染料都可以在488nm被激發(fā)，它們可同時(shí)與兩種不同的抗體結(jié)合，F(xiàn)ITC的熒光發(fā)射在綠區(qū)，大約530nm，而PE的發(fā)射在橙紅區(qū)，大約在570nm以上，它們適用于同時(shí)區(qū)分不同抗原位點(diǎn)的細(xì)胞群流

9、式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用20三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)免疫熒光染料： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 在實(shí)驗(yàn)中，染色后的標(biāo)本常常不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè)。在這種情況下，應(yīng)該把染好的標(biāo)本進(jìn)行固定流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用21三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： FCM免疫方法對(duì)固定劑的要求比較嚴(yán)格，固定劑必須有效地固定細(xì)胞并保護(hù)細(xì)胞內(nèi)抗原或細(xì)胞膜表面抗原特性不受破壞，又必須使被固定細(xì)胞的細(xì)胞膜對(duì)抗體有一定的通透性，使其能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用22三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 三

10、、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 醇類、醛類固定劑易導(dǎo)致所固定的細(xì)胞縮小變形，一般常用1-4%的多聚甲醛緩沖液(pH7.4)進(jìn)行固定，或用0.37-1.5%的甲醛緩沖液(pH7.4)固定，固定液加入后混勻置4儲(chǔ)存，一般不超過(guò)一周，在上機(jī)前用PBS或相應(yīng)的緩沖液洗滌流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用23三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 這種固定方法對(duì)染色后的標(biāo)本來(lái)說(shuō)，固定程序簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞體積，光散射及熒光特性都無(wú)明顯影響。另外，這些醛類的固定劑的另一優(yōu)點(diǎn)是具有消毒作用，能夠殺滅組織中存在的各類肝炎病毒，也可滅活其他傳染性毒素，

11、對(duì)工作人員的自我保護(hù)來(lái)說(shuō)，它是很好的固定劑和消毒液流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用24三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 同時(shí)，在單細(xì)胞懸液制備過(guò)程中不能使用酶消化方法，否則將破壞細(xì)胞膜表面抗原物質(zhì)結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用25三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)標(biāo)本的保存和固定： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 在FCM樣品制備過(guò)程中，不同細(xì)胞亞群的免疫熒光測(cè)定，應(yīng)設(shè)定一個(gè)陽(yáng)性與陰性對(duì)照流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用26三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 如對(duì)

12、淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞懸液用抗白細(xì)胞抗體和抗淋巴細(xì)胞抗體進(jìn)行標(biāo)記，將細(xì)胞懸液分為三份流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用27三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 第一份細(xì)胞懸液直接加入二抗(FITc-羊抗鼠IgG)；第二份懸液先加入抗白細(xì)胞抗體，然后在加入第二抗體；第三份懸液先加入抗淋巴細(xì)胞單克隆抗體，再加入第二抗體流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用28三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 分別將這三種標(biāo)記后的細(xì)胞懸液上機(jī)檢測(cè)，第一份懸液細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最低，無(wú)陽(yáng)性結(jié)合細(xì)胞，第二份有少量的細(xì)胞

13、表達(dá)，說(shuō)明該懸液中自細(xì)胞較少，第三份有較多的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，證明有大量的淋巴細(xì)胞存在流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用29三、免疫熒光測(cè)定的標(biāo)本處理技術(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)和陰性對(duì)照： 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記 與人體免疫功能有關(guān)的主要是淋巴細(xì)胞，具有細(xì)胞免疫功能主要是淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞亞群，而B(niǎo)細(xì)胞與體液免疫功能有關(guān)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用30四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記 與人體免疫功能有四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的功能: T細(xì)胞亞群在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用，T細(xì)胞亞群的變化直接影響機(jī)體的免疫狀態(tài)的強(qiáng)弱和結(jié)局，對(duì)于適應(yīng)性免疫反應(yīng)功能在時(shí)間、空間層面上的質(zhì)與量的評(píng)價(jià)，可以通過(guò)T細(xì)胞亞群分布

14、和功能檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn) 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用31四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的功能: 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的功能: 目前越來(lái)越多的研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群在各種臨床疾病(如：造血系統(tǒng)疾病，病毒感染和惡性腫瘤等)都有異常改變。 在各種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中測(cè)定人外周血中T抑制(T8)和T輔助(T4)淋巴細(xì)胞亞群比例，可用來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)平衡狀態(tài)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用32四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的功能: 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的功能: 測(cè)定T亞群的相對(duì)標(biāo)記率，特別是T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，可以幫助研究各種與免疫有關(guān)的疾病發(fā)病機(jī)制。

15、所以，它可以作為臨床免疫研究的手段，成為臨床檢驗(yàn)的一項(xiàng)重要指標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用33四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的功能: 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：抗原識(shí)別：主要通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞受體(簡(jiǎn)稱為T(mén)CR)與其相應(yīng)的配體(MHC-主要組織相容性復(fù)合物)2 T細(xì)胞活化：活化早期可以檢測(cè)活化的表型物質(zhì)CD25、CD71、CD69或MHC-分子和細(xì)胞因子IFN-、TNF-2等。也可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高和酪氨酸磷酸化酶等流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用34四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：抗原識(shí)四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：T細(xì)胞

16、增殖：DNA細(xì)胞周期和Brdu摻入法，或者分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白等(如Cyclin-D1、D2、D3、E）4 T細(xì)胞克隆擴(kuò)增：可以檢測(cè)T細(xì)胞受體V基因片斷產(chǎn)物，應(yīng)用其相應(yīng)單克隆抗體，定量分析基因片斷的取用頻率，這是一項(xiàng)檢測(cè)T細(xì)胞克隆的新技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用35四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：T細(xì)胞四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：T細(xì)胞分化：Th (Th1 Th2)， Ts (Tsc/ Ts)可以用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子以及體液或培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子，應(yīng)用微球夾心免疫熒光法，這是近年來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用36四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)

17、記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：T細(xì)胞四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：6 T細(xì)胞的效應(yīng)作用：可以檢測(cè)Fas、 FasL、顆粒酶或可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡指數(shù)Annexin-V(磷酸酯絲氨酸酶)等，也可檢測(cè)Caspase酶(凋亡酶系統(tǒng))T細(xì)胞免疫記憶功能：常用 CD45亞型(CD45RO)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用37四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的功能及檢測(cè)參數(shù)：6 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的免疫表型：根據(jù)T淋巴細(xì)胞免疫表型和功能分為T(mén)總淋巴細(xì)胞 CD3+T輔助性細(xì)胞 CD4+/CD3+T抑制性細(xì)胞 CD8+/CD3+NK細(xì)胞 CD56+/CD3+流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)

18、用38四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞的免疫表型：根據(jù)T淋巴細(xì)四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用39四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用39四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用40四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用40四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用41四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用41四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記FCM檢測(cè)T細(xì)胞亞群的參考值：細(xì)胞表面抗原正常人參考范圍CD361.1%77.0 %CD435.4 % 52.0 %CD818.4 % 31.2 %CD56

19、10.4 % 19.8 %CD4/CD80.98 1.94 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用42四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記FCM檢測(cè)T細(xì)胞亞群的參考值：四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：1 T3+升高、T4+升高提示免疫功能增強(qiáng)，在這里并不單指細(xì)胞數(shù)量增加，還應(yīng)該將T3+、 T4+表達(dá)量(熒光量)增加也視為免疫功能增強(qiáng)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用43四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：1 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：2 T8+升高提示免疫功能降低，但是T抑制細(xì)胞中有一群T毒性細(xì)胞，當(dāng)T毒性細(xì)胞增高時(shí)常產(chǎn)生自體及異體細(xì)胞破壞功能增強(qiáng)，那將造

20、成自身免疫性疾病的發(fā)生，在器官移植術(shù)后產(chǎn)生對(duì)異體器官的排異反應(yīng)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用44四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：2 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：3 NK細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性增加，表達(dá)自然殺傷功能增強(qiáng)和執(zhí)行免疫監(jiān)視功能增強(qiáng)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用45四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：3 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：T4/T8比值升高提示免疫功能增強(qiáng)，但常與一些自身免疫性疾病有關(guān)(如類風(fēng)濕、塞萊斯氏綜合癥)T4/T8比值降低提示免疫功能降低，如在惡性腫瘤、病毒感染、再障性貧血等，尤其在AIDS病時(shí)具有特

21、異性極高的診斷價(jià)值流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用46四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群的生物學(xué)意義：T4/四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序： 在進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群標(biāo)記時(shí)，目前人們常利用全血進(jìn)行標(biāo)記，在加入抗體后加入lysing紅細(xì)胞溶解液，3-5min后，加入PBS洗去血紅蛋白，并重新懸浮于lml PBS中，上機(jī)檢測(cè)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是，用血量少，一般每種抗體用全血20ul即可，且操作步驟簡(jiǎn)便流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用47四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序： 四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：Lysing溶解液的配制:0.83%氯化

22、胺，0.55mM Na-EDTA0.1%碳酸氫鉀，調(diào)pH7.3流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用48四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：L四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免疫熒光直接標(biāo)記法l) 取淋巴細(xì)胞混懸液l106細(xì)胞/ml，50ul2) 加入標(biāo)有熒光素的單克隆抗體工作液50ul3) 37水浴30min，避光4) 加入PBS 10ml，混勻5) 離心1000rpm，10min，棄上清流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用49四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免疫熒光直接標(biāo)記法6) 重

23、復(fù)4、5步驟7) 加入1ml PBS 緩沖液混勻8) 上機(jī)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用50四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免疫熒光間接標(biāo)記法l) 取淋巴細(xì)胞混懸液l106細(xì)胞/ml，50ul2) 加入抗T細(xì)胞亞群的單抗工作液50ul3) 37水浴30min4) 加入PBS 10ml混勻5) 離心1000rpm，10min，棄上清流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用51四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免疫熒光間接標(biāo)記法6) 加入FITC羊

24、抗鼠IgG第二抗體50ul7) 37水浴30min，避光8) 加入10ml PBS，混勻9) 離心1000rpm，10min，棄上清流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用52四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免疫熒光間接標(biāo)記法l0) 重復(fù)8、9步驟11) 加入1ml PBS 液混勻12)上機(jī)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用53四、T淋巴細(xì)胞及其亞群免疫標(biāo)記T細(xì)胞亞群流式免疫標(biāo)記程序：免五、造血系統(tǒng)的分化抗原及白血病抗原標(biāo)記 骨髓是一個(gè)細(xì)胞群體的造血器官，正常人出生后，它是血細(xì)胞唯一的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化的場(chǎng)所，淋巴、單核、巨噬、粒系

25、在正常分化成熟過(guò)程的不同階段出現(xiàn)或消失細(xì)胞表面抗原。這些抗原是具有一定功能的生物效應(yīng)分子，它們參與免疫應(yīng)答和調(diào)控作用流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用54五、造血系統(tǒng)的分化抗原及白血病抗原標(biāo)記 骨髓流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用培訓(xùn)課件五、造血系統(tǒng)的分化抗原及白血病抗原標(biāo)記 用單抗可以將急淋分為:T細(xì)胞急淋(T-ALL)，B細(xì)胞急淋(B-ALL)，普通型急淋(C-ALL)和無(wú)標(biāo)志型急淋(NULL-ALL)。 它們?cè)谥委熀皖A(yù)后上不同，所以，利用不同類型白血病細(xì)胞上表達(dá)某些分化抗原這一特點(diǎn)，可以對(duì)白血病進(jìn)行詳細(xì)分型，并給予導(dǎo)向治療流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用56五、造血系統(tǒng)的分化抗原及白血病抗原標(biāo)記 用單抗五、造血系

26、統(tǒng)的分化抗原及白血病抗原標(biāo)記 此外，白血病細(xì)胞膜表面標(biāo)記的表達(dá)與預(yù)后之間也有密切關(guān)系 流式免疫熒光標(biāo)記造血系統(tǒng)的細(xì)胞抗原，其基本原理，實(shí)驗(yàn)方法，步驟與淋巴細(xì)胞亞群免疫標(biāo)記相同，不再贅述流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用57五、造血系統(tǒng)的分化抗原及白血病抗原標(biāo)記 此外，六、血小板膜表面受體的標(biāo)記 血小板是巨核細(xì)胞分化成熟后，巨核細(xì)胞漿裂解脫落的小塊細(xì)胞質(zhì)，它的最表層富含糖蛋白和一些酶，是血小板表面特異吸附的血漿成分，也是血小板粘著、聚集的反應(yīng)部位，血小板膜上含有多種與凝血有關(guān)的因子，在止血，凝血，維持血管內(nèi)皮的完整性方面具有重要的生理功能流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用58六、血小板膜表面受體的標(biāo)記 血小板是巨核

27、細(xì)胞分化六、血小板膜表面受體的標(biāo)記 目前認(rèn)為與血小板有關(guān)的血小板膜受體有2b、3a、2b-3a復(fù)合物，1b、VWF、GMP-140、Fg等。其檢測(cè)方法不盡相同，有SDA法，交叉免疫電泳法，這種方法難于檢出較低含量的膜受體，而免疫印跡法的靈敏度較高，但標(biāo)本用量大，操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)，膜純化過(guò)程中受體變化大，易丟失。臨床實(shí)驗(yàn)室較少應(yīng)用放免法，易受其他細(xì)胞的干擾或一個(gè)抗原分子結(jié)合多個(gè)抗體而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高等缺點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用59六、血小板膜表面受體的標(biāo)記 目前認(rèn)為與血小板有關(guān)六、血小板膜表面受體的標(biāo)記 用FCM檢測(cè)血小板膜受體，是分析血小板方法學(xué)上的重要進(jìn)展，它從分子水平診斷血小板功能和數(shù)量的

28、異常，方法操作簡(jiǎn)便、快速、特異和準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，且標(biāo)本的用量少，能靈敏地從大量血小板中檢出2%受體陽(yáng)性或陰性的血小板。因此，流式細(xì)胞測(cè)定血小板膜受體數(shù)量和功能很適合作為臨床檢驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用60六、血小板膜表面受體的標(biāo)記 用FCM檢測(cè)血小板六、血小板膜表面受體的標(biāo)記1. 血小板懸液的制備1) 聚丙烯一次注射器取靜脈血1-2ml，用3.8%的枸櫞酸鈉或1%Na2EDTA抗凝置塑料管中。2) 800轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上層血漿，可獲得富血小板血漿(PRP)。3) 將PRP3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,血小板沉淀?xiàng)壣锨辶魇郊?xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用61六、血小板膜表面受體的標(biāo)記1. 血小板懸

29、液的制備流式細(xì)胞術(shù)在六、血小板膜表面受體的標(biāo)記血小板懸液的制備4) 加入0.2ml ACD溶液懸液懸浮，再加入1ml，Tyrode液，混勻。5) 離心3000轉(zhuǎn)/分15分鐘，棄上清。6)重復(fù)4.5步驟。7) 加入lml 2%多聚甲醛，或2%戊二醛，室溫30分鐘，將其血小板固定，放置4冰箱保存可達(dá)1個(gè)月之久流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用62六、血小板膜表面受體的標(biāo)記血小板懸液的制備流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)六、血小板膜表面受體的標(biāo)記2. 血小板膜受體的標(biāo)記步驟1) 取固定后的血小板懸液離心2500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，去上清。2) 加入抗血小板膜受體的相應(yīng)抗體工作液0.lml，室溫孵育30分鐘。3) 加入5mlTES懸浮液2500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清，并懸浮流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用63六、血小板膜表面受體的標(biāo)記2. 血小板膜受體的標(biāo)記步驟流式細(xì)4) 加入FITC羊抗IgG第二抗體工作液0.1ml室溫孵育30分鐘。5) 重復(fù)3)步驟。6) 加入lmlTES懸浮液將血小板懸浮。7)上機(jī)檢測(cè)六、血小板膜表面受體的標(biāo)記2. 血小板膜受體的標(biāo)記步驟流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用644) 加入FITC羊抗IgG第二抗體工作液0.1ml室溫孵育七、FCM在AIDS病檢測(cè)的應(yīng)用 愛(ài)滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，是一種近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的免疫性疾病。其臨床