齊魯醫(yī)學(xué)酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗

1、實驗五 酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗(Experiments on enzyme kinectics) 遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 朱 欣 婷2021/9/301 生化教研室 朱欣婷1.觀察底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響。2.觀察抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響。3.掌握用雙倒數(shù)作圖法測定堿性磷酸酶的km值。2021/9/302 生化教研室 朱欣婷 酶促反應(yīng)動力學(xué):影響酶促反應(yīng)速度(V)的因素: 研究酶促反應(yīng)的速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。1.底物濃度 S 2.酶的濃度 3.溫度 4.pH5.酶的激活劑 6.酶的抑制劑2021/9/303 生化教研室 朱欣婷（一）底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 當?shù)孜餄舛容^低

2、時,V隨S的增大而急劇上升,兩者成正比關(guān)系.隨著底物濃度繼續(xù)增加,反應(yīng)速度增加,而幅度不斷下降,若繼續(xù)加大S反應(yīng)速度就不再增加,達到一個極限值Vmax.VmaxS(V)2021/9/304 生化教研室 朱欣婷S與V的關(guān)系:米-曼氏方程Vmax - 最大反應(yīng)速度 Km - 米氏常數(shù)當V1/2Vmax時，KmS Km值的物理意義:即Km值是當酶反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度。2021/9/305 生化教研室 朱欣婷Km和Vmax值的測定 (1)測定不同底物濃度的反應(yīng)初速率，以V-S作 圖可以得到Vmax，再從1/2Vmax，可求得相應(yīng)的 S，即Km值。 Vmax VmaxSvKm2021

3、/9/306 生化教研室 朱欣婷 (2)雙倒數(shù)作圖法：將米氏方程式兩側(cè)取雙倒 數(shù)，以1/V-1/S作圖，得出一直線.Km和Vmax值的測定2021/9/307 生化教研室 朱欣婷（二）抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響 酶的抑制劑：抑制作用類型可逆性不可逆性競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制 凡能降低酶的活性，甚至使酶完 全喪失活性，但不使底物變性的物質(zhì)。2021/9/308 生化教研室 朱欣婷1.競爭性抑制曲線圖 競爭性抑制劑與酶的底物結(jié)構(gòu)相似,與底物競爭酶的活性中心,從而阻礙酶與底物的結(jié)合.特點:（1）V下降，發(fā)生抑制（2）Vmax不變（3）Km增大，親和力下降2021/9/309 生化教研室 朱

4、欣婷2.非競爭性抑制曲線圖 抑制劑與酶活性中心以外的必需基團結(jié)合,不影響酶與底物的結(jié)合,底物與抑制劑之間沒有競爭關(guān)系.特點:（1）V下降，發(fā)生抑制（2）Vmax減小（3）Km不變2021/9/3010 生化教研室 朱欣婷3.反競爭性抑制曲線圖特點:(1) V下降，發(fā)生抑制(2) Vmax減小(3) Km減小2021/9/3011 生化教研室 朱欣婷（三）本次實驗方案堿性磷酸苯二鈉 本次實驗以 為底物, 為催化劑, 作為抑制劑，分別觀察無抑制劑和有抑制劑時底物濃度與酶促反應(yīng)速度之間的關(guān)系。磷酸酶AKP磷酸氫二鈉2021/9/3012 生化教研室 朱欣婷C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=

5、O H3C-NOH+ C6H5NH3C-NH3C-CC-N= C=O H3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二鈉+ H2O AKPOHHO-P=OONaONa+ 酚 醌衍生物為紅色,根據(jù)紅色深淺測出光密度值,計算不同底物濃度時酶的反應(yīng)速度（以產(chǎn)物的生成量表示）,以1/V-1/S雙倒數(shù)作圖，獲得Km值。2021/9/3013 生化教研室 朱欣婷添加試劑（兩人一組，1人按照p45 ，另1人按照p50 的要求量取溶液）37攝氏度水浴準確保溫15分鐘立即加入堿性溶液1.10ml終止反應(yīng)0.3%4-氨基安替比林1.00ml0.5%鐵氰化鉀2.00ml每步

6、充分混勻,室溫放置10分鐘以0管調(diào)零,波長510nm比色2021/9/3014 生化教研室 朱欣婷計算公式1.計算出無抑制劑和有抑制劑時各管中底物濃度S.2.計算出無抑制劑和有抑制劑時各管的反應(yīng)速度V. 反應(yīng)速度用產(chǎn)物的生成量來表示: 每ml酶液在37反應(yīng)15分鐘產(chǎn)生酚的量S=C基質(zhì)液V基質(zhì)液/V總產(chǎn)物生成量=A測/A標 C標酚 V標酚 1ml/ 0.1ml2021/9/3015 生化教研室 朱欣婷12345678標AAi表1.不同底物濃度時溶液的光密度值 12345678標 S (mol/L)1/S (mol/L)-1 V (mg/15min) 1/V (mg/15min) -1 Vi (m

7、g/15min)1/Vi (mg/15min) -1計算結(jié)果表2.底物濃度及反應(yīng)速度2021/9/3016 生化教研室 朱欣婷作圖1/S1/V-1/Km 根據(jù)圖獲得Km,并判斷磷酸氫二鈉為何種抑制劑.時間:儀器型號:儀器編號:作圖者:1/Vmax2021/9/3017 生化教研室 朱欣婷1.兩人一組，一人做無抑制劑的，另一人做有抑制劑的實驗。2.取樣量準確,保溫準確，加樣順序要一致，每步均混勻。3.同一組實驗用相同的比色計。4.作圖時,實驗點不在同一條直線上時,盡量使各點平均分布在直線的兩側(cè),兩圖畫在同一坐標紙上,便于判斷。2021/9/3018 生化教研室 朱欣婷1.米氏常數(shù)（Km）有無單位？為什么？2.本實驗中能否不用計算反應(yīng)速度，直接以各管 測得的光密度代表各管中酶的反應(yīng)速度行不行？為什么？3.如果不用本實驗原理中所列的幾種變換公式，是否還可以從實驗結(jié)果求出Km