2015年國家自然科學(xué)基金面上項目示例版

1、2015 年國家自然科學(xué)基金面上項目示例版題目：真核起始因子X-Y 軸調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶關(guān)于腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用機制摘要：相關(guān)分子標(biāo)志中發(fā)現(xiàn)真核起始因子Z家族的成員和Y具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用X-Y 軸能夠介導(dǎo)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生可促進(jìn)細(xì)胞獲得運動能力并且且在轉(zhuǎn)移灶中經(jīng)過Y的相互作用促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。進(jìn)一步實驗證實，X能調(diào)節(jié)下游糖基轉(zhuǎn)異性受體相互作用而使腸癌細(xì)胞“定居”于肝臟的機制，可見X-Y調(diào)節(jié)軸關(guān)于于大腸癌肝轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。本項目擬在此基礎(chǔ)上，從大樣本回顧性分析中總結(jié)X-Y關(guān)于進(jìn)一途徑及靶點。（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容4000-8000字：一、立項依據(jù)大腸癌是一種發(fā)生在結(jié)腸或者直腸中的癌癥，是最常見的惡性腫瘤之

2、一，全球每年新發(fā)病人約八百萬，占一切惡性腫瘤的 10%-15%，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第三位1。隨著手術(shù)、化療、放療水平的提高，大腸癌患者的生存率有了較大的提高，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的最主要因素。在美國大腸癌中有90%的死亡由腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移所致2。所以，經(jīng)過關(guān)于大腸癌轉(zhuǎn)移機制的研究，正確認(rèn)識大腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移模式，關(guān)于于制定合理的術(shù)后隨訪方案，采取有針關(guān)于性的干預(yù)措施，提高生存率至關(guān)重。而首先出現(xiàn)在肺部甚至是甲狀腺轉(zhuǎn)移6%，已經(jīng)相當(dāng)可觀486 術(shù)后肺轉(zhuǎn)移率和肝轉(zhuǎn)移率都沒有顯著性差異。由此可見，決定大腸癌的術(shù)后轉(zhuǎn)移模式的因素并且非僅僅解剖可以闡為搜尋大腸癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)分子靶標(biāo)并且評估其作為預(yù)

3、測遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移發(fā)生的潛在分子標(biāo)志物的可能性，我們前期在臨床上收集了6 例珍貴的同時性肝、肺轉(zhuǎn)移訣別切除的患者，將其原發(fā)灶、肝、肺轉(zhuǎn)移的組織樣本經(jīng)過高通量的基因芯片技術(shù)，從全基因表達(dá)譜的角度關(guān)于這兩種轉(zhuǎn)移組織的基因表達(dá)情況進(jìn)行了全方位（來源于同一患者的組織樣本可以排除個體遺傳背景的干擾。我們41個基因在兩種大腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織中存在顯著性差異（肝轉(zhuǎn)移分子7447 22qPCR13個（5。這些肝轉(zhuǎn)移特異的分子標(biāo)志中ZX和，引起了我們的研究關(guān)切Z真核起始因子在真核生物翻譯起始進(jìn)程中起著YY 表達(dá)被干擾后，細(xì)胞增殖能力被顯著克制，處于G1 期的細(xì)胞數(shù)量顯減少，處于SG2期的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，細(xì)胞凋亡比例顯著

4、提高，細(xì)胞的存活能力顯著下降，克隆形成能力受到顯著克制。這一結(jié)果 已發(fā)表于?？紤]到XY之間存在相互接合YX表達(dá)之YX本身具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的能力，克制X可顯著降低細(xì)胞運動性（見前期工作。由此，我們提出科學(xué)假設(shè)：真核起始因子Y 軸能夠調(diào)控大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生X 可介導(dǎo)細(xì)胞獲得運動能力，并且且在轉(zhuǎn)移灶中調(diào)節(jié)Y 發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繼發(fā)性增殖的作，具體作用機制有待闡明。在哺乳動物中，Z8種，按分子量從大到小排列而命名。Z 。據(jù)報道，ZmRNA40s亞基接合，而且還可以獨自40s亞基接合，影響40s60s亞基及其他亞基蛋白的接合或解離等ZPCIMPN蛋白相互作用，部分還具有RNA 識別（RNA motif，R

5、RM）結(jié)構(gòu)域，可RNA 的接合。除此之外，Z 因子還被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細(xì)胞周期的作用mRNA的翻譯起始，Z因子就可以選擇性地調(diào)控蛋白的合成，從而關(guān)于腫瘤細(xì)胞的生長的轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控。Z 家族中部分成員已證實在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，已報道的囊括：A、B、C、 等18-22。Y 的致癌作用由申請人首先報道，隨后其在膠質(zhì)瘤和呼吸系統(tǒng)腫瘤中的作用也被其他研究者發(fā)而關(guān)于 X 與惡性腫瘤的關(guān)系目前還未見文獻(xiàn)報道Y 兩個分子尤其是交互作用方面人尚居于領(lǐng)先的研究地位。JChem上的報道提示了X在包含Y蛋白的復(fù)合物與40SX時兩者的接合很不穩(wěn)定，關(guān)于翻譯起始系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力也會降低。20139月，J

6、Chem上又報道了W可與X競爭性接合，從而形成不同的ZZ復(fù)合物負(fù)責(zé)招募tRNA 或Z 因子蛋白接合可能存在不同的翻譯調(diào)節(jié)機制從而執(zhí)行不同功能作用。X 敲減 X后，基因芯片檢測顯示腸癌細(xì)胞中多個關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點發(fā)生了改變。其中，3 個半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（1,3-GalT; 1,4-GalT-1; 的表達(dá)降低了， 相關(guān)Tang等發(fā)現(xiàn) 1 經(jīng)過調(diào)節(jié)EGFR影響肝癌細(xì)胞的生長和凋亡 1,4-3 經(jīng)過調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白信號通路影響神經(jīng)細(xì)胞瘤的侵襲能力。此外，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的激活，可以使細(xì)胞膜上蛋白糖基化程度增加。與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 1,4-GT-1和,T7 我們推測 X 關(guān)于半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)作用很可能是它在腸癌中介

7、導(dǎo)腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的關(guān)存在一種特異性表達(dá)的抗原：去唾液酸糖蛋白受體（receptor, P。PR 肝竇狀隙的肝實質(zhì)細(xì)胞表面，密度很高，每個細(xì)胞表面可多達(dá)500,000個受體，其胞外結(jié)構(gòu)域含有糖識別結(jié)構(gòu)域，能識別和接合半乳糖殘基和-乙酰半乳糖胺殘aewl，使細(xì)胞膜表面的糖蛋白脫去唾液酸而暴露出半乳糖殘基，利用半乳糖殘基與ASGPR 的相互作用使 BMCs 直接云集到肝臟。我們相信，真核起始因子X 在腸癌肝轉(zhuǎn)移的進(jìn)程中，可能調(diào)節(jié)下游糖基轉(zhuǎn)移酶，存在一種經(jīng)過激活腸癌細(xì)胞膜表面半乳糖殘基ASGPR 相互作用而使腸癌細(xì)胞定居于肝臟的機制，此后，它又可介導(dǎo) Y 的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞克隆化增殖的能X-Y 調(diào)節(jié)軸關(guān)于

8、于大腸癌肝轉(zhuǎn)移的內(nèi)在調(diào)節(jié)機理是令人期待的。X-Y 關(guān)于于結(jié)腸癌X 調(diào)節(jié)半乳糖苷X Y 復(fù)合物并且經(jīng)過分子機制研究進(jìn)行縱向的突破，以期獲得高水平的研究成果。應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)奠定理論基礎(chǔ)。主要參考文獻(xiàn)因涉敏感基因信息， 略二、項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題1、研究內(nèi)容500 X Y 蛋白的表達(dá)水平，根據(jù)臨床XY表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生的相關(guān)性，嘗XYXY基因，觀察細(xì)胞功能變化。在細(xì)胞實驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用裸鼠成瘤和肝轉(zhuǎn)移動物模型進(jìn)行驗證，觀察、Y關(guān)于于腸癌惡X、Y在腸癌發(fā)生、進(jìn)展中的功能作用。與糖基轉(zhuǎn)移酶XYY相互接合的序列位點和精細(xì)調(diào)控。研究目標(biāo)及考核的技術(shù)指標(biāo)Y在腸癌細(xì)胞高表達(dá)能促

9、進(jìn)細(xì)胞惡性增殖和周期改變，XY之間存X X-Y 可介導(dǎo)細(xì)胞獲得運動能力并且在轉(zhuǎn)移灶中調(diào)節(jié)YX調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的分子機制經(jīng)過以下兩個目標(biāo)進(jìn)行深入探討：Y復(fù)合物調(diào)節(jié)的信號通路與效應(yīng)分子；XY相互接合的序列位點和精細(xì)調(diào)控； 3）探討X調(diào)節(jié)大腸癌肝轉(zhuǎn)移模式的具體作用機制。擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題及其解決方法X Y 在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的臨床個靶標(biāo)的檢測有成熟的商業(yè)化抗體，方法學(xué)上也不存在困難。X-Y 軸在大腸癌肝轉(zhuǎn)移Y 所介導(dǎo)的遷移功能及糖基轉(zhuǎn)移酶信號途徑Y(jié)X接合的精細(xì)調(diào)控及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖YX YX能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，并且影Y 關(guān)于腫瘤的促增殖作用，在此基礎(chǔ)上做機制研究有的放矢。其次，我們已篩X 可經(jīng)過調(diào)節(jié)

10、兩個糖基轉(zhuǎn)移酶關(guān)于腸癌細(xì)胞肝臟種植起到調(diào)節(jié)作用， X 如何調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移功能，其下游X 作用通路的神奇面紗。最后，YX之間的有創(chuàng)新性且立足于前期研究的X-Y 復(fù)合物調(diào)節(jié)的位點和下游與細(xì)胞增殖功能相關(guān)的機制闡參考模式豐富，這方面的研究也不會有太大的科學(xué)風(fēng)險。三、擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析技術(shù)路線基因芯片基因芯片鑒 在腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中特異性高定達(dá)基RNA i病因毒感染感染基RNA慢病因毒沉默SW1116細(xì)胞增殖能力顯沉默SW1116細(xì)胞增殖被后著后遷移能著降低低X基因過表達(dá)慢病毒Y沉默后，過表感染X，SW1116細(xì)感染Y基因過表達(dá)慢病毒SW1116細(xì)達(dá)增殖有稍許增強胞增殖、遷移

11、無顯著影胞響X- 軸可能調(diào)控大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)裸鼠移植瘤模型Y 生EMSA/Co- 實基因芯片篩 X沉in驗X- 軸viY 成瘤能力的影響選后下游分子變默化IP 蛋證 白相互作用500例腸癌組樣本的收集半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 可 X調(diào)節(jié)腸癌細(xì)肝轉(zhuǎn)模式的關(guān)鍵關(guān)于X的序列進(jìn)行分段，分載體， Co- 的方用 檢測 YP 法與域裸鼠腸癌肝轉(zhuǎn)移模型qPC、WB驗X關(guān)于乳糖基轉(zhuǎn)移酶的半控關(guān)于目標(biāo)序列區(qū)域進(jìn) 行析，設(shè)計點突 ， XY接合的位證點in驗X- 軸免疫組化 蛋表達(dá)和白位根據(jù)臨床的病理 /預(yù)后和隨訪資分 的臨床意義o 移能力的影響半乳糖基轉(zhuǎn)移酶克制 驗證其 X介導(dǎo)腸癌中的作用闡X- 在腸癌肝轉(zhuǎn)作用及機制備注：

12、藍(lán)色背景填充部分為前期已完成工作。研究方法、Y在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和預(yù)后相關(guān)性500例，取手術(shù)切除的腸癌組織、匹配的肝臟轉(zhuǎn)移200300例，全部病歷均經(jīng)過臨床、影像學(xué)、病理診斷，術(shù)前未進(jìn)行扶助治療，來自某某醫(yī)院2008-2013年臨床收治病歷，隨訪資料齊全。XY蛋白的表達(dá)及定位，訣別設(shè)立陰性關(guān)于照、腫瘤關(guān)于照、肝轉(zhuǎn)移關(guān)于照。SPSS16.0 統(tǒng)計軟件關(guān)于 XY 表達(dá)及定位與臨床標(biāo)本進(jìn)行病理關(guān)聯(lián)性分析和預(yù)后統(tǒng)計分析，了解X、Y 表達(dá)情況與相關(guān)臨床資料之間的關(guān)系，單因素生存Cox比例風(fēng)險回歸模型，綜合探討臨床各因素和XY表達(dá)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶形成及預(yù)后的相關(guān)性。體外、體內(nèi)水平研究、Y基因

13、在腸癌肝轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)功能X-shRNAX穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株，以無義序列作為陰性關(guān)于照，利用MTTX沉默后細(xì)胞的生長曲線；克隆形成實驗檢測X沉PI雙染檢測細(xì)Transwell 實驗觀察細(xì)胞運動能力的變化。X的慢病毒載體。X Y 的慢病毒載體，利用細(xì)胞生X 沉默且 Y 過表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力變化；細(xì)胞劃痕實驗、TranswellY的結(jié)腸癌XY沉默&X過Transwell 實驗觀察細(xì)胞運動能力的變化。YX關(guān)于結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響，明確Y和X在結(jié)腸癌惡性增殖的作用。實驗分組：空白關(guān)于照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達(dá)組、Y沉默組+X過表達(dá)組。Y X 關(guān)于結(jié)Y X 在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的作

14、用。實驗分組：空白關(guān)于照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達(dá)組、Y沉默組+X 過表達(dá)組。qRT-PCRY/X以及下mRNA 和蛋白的表達(dá)；部分腫瘤組織制備成冰凍切片，利FITC和TRITCX Y 的共定位情況。2.3. X-Y軸調(diào)節(jié)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子機制研究X過表達(dá)/沉默后基因表達(dá)譜變化情況，關(guān)于原X消減后表達(dá)發(fā)生改變的下游調(diào)控分子，芯片結(jié)果中有顯著差異的潛在作用分子，設(shè)計引物，經(jīng)過qRT-PCR進(jìn)行二次表達(dá)驗證。X基因過表達(dá)/Network、Genes2Networks、 network X調(diào)X為核心的信號分子網(wǎng)絡(luò)。X（半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其上游調(diào)節(jié)信號通路X穩(wěn)定過表達(dá)/沉默后結(jié)腸癌細(xì)胞和關(guān)

15、于照細(xì)X在結(jié)腸癌中的功能表型的影響。采用信號通路高通量檢測蛋白芯片，根據(jù)以上實驗分析的通路情況，訂購相Pathway試劑盒，按試劑盒操作，依據(jù)封閉、加入細(xì)胞裂解液、洗脫、加入抗體混合液、再次洗脫，加入辣根過氧化物酶HRP 并且洗脫、X基因表達(dá)變化后的特定通路關(guān)鍵蛋白的變化。X、Y293T，經(jīng)過免疫共沉淀驗XY的相互接合作用。X Y 的接合位點。在接合位點制備不同氨基酸XY之間的接合位點特異性。EMSAXY之間的相互作用關(guān)系，參考蛋白相互作用實驗，設(shè)X Y 調(diào)節(jié)蛋白其關(guān)于下游RNA進(jìn)行調(diào)控的精細(xì)機制?？尚行苑治隹梢哉{(diào)節(jié)結(jié)腸癌的惡性前期研究工作的進(jìn)一步補充和完備，具有較好的可行性。PCR、RNA干擾、慢病主要儀器設(shè)備目前均已經(jīng)具備。(1000余例的研究專長，能保證本實驗的順利完成。本項目的特色與創(chuàng)新之處和Y是ZX-YX-Y 軸在結(jié)腸癌癌中的功能作用和與癌變的關(guān)系還是未知領(lǐng)YYX 的交互作用進(jìn)行研究，能夠進(jìn)一步形成創(chuàng)新的研究成果。研究工作的進(jìn)度安排本項目預(yù)計在 4 年內(nèi)完成，具體進(jìn)展計劃如下：2015.012015.12PCRXYYshRNA慢病毒構(gòu)建、包裝和純化，細(xì)胞功能檢測