中草藥鑒定種特異性DNA探針的篩選方法

1、中草藥斷定種特異性DNA探針的挑選要領(lǐng)【摘要】基因芯片技能為中草藥高效、并行、快速斷定提供了大概。而中草藥種特異性探針的挑選是中草藥基因芯片斷定技能開拓的關(guān)劍文章結(jié)合當(dāng)今中藥區(qū)分芯片和別的物種斷定芯片研究希望總結(jié)了幾種得當(dāng)中草藥特異性探針挑選的要領(lǐng)?！娟P(guān)鍵詞】基因芯片；中草藥區(qū)分；種特異；DNA探針Abstrat:DNAhiptehnlgyakesitfeasibletidentifyhineseherbalediinerapidly,effiientlyandinparallel.Thesreeningfspeies-speifiDNAprbesfrediinalplantsisthekey

2、stepindevelpingDNAhipfrtheauthentiatinfhineseherbalediines.binedithurrentDNAhipresearhesnidentifiatinfherbalplantsrtherspeies,seethdsavailablefrthesreeningfediinalplantsspeies-speifiDNAprbeseresuarizedinthispaper.Keyrds：DNAhip;Herbalediine;Speies-speifiDNAPrbe在中藥材基因區(qū)分和特性性基因測序的底子上，創(chuàng)立以基因診斷和基因芯片為載體的中藥材

3、分子區(qū)分技能和要領(lǐng)是以后中藥生物技能研究中的積極標(biāo)的目的之一1。中藥斷定的基因芯片技能是指接納原位合成或顯微打印本領(lǐng)，將中藥種特異性DNA探針結(jié)實(shí)在玻璃片、尼龍膜或別的支持物外貌上，形成二維DNA探針陣列，然后與熒光或DIG標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟待檢中藥基因組DNA樣本雜交，通過檢測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥的正確、并行、高效地檢測。固然DNA芯片技能已普及應(yīng)用于DNA測序2、單核苷酸多態(tài)性闡發(fā)3、基因表達(dá)闡發(fā)4、基因診斷5、藥物挑選6、微生物種類斷定等7各個(gè)方面，但應(yīng)用于中藥斷定尚處于起步階段，比年來隨著基因芯片技能的普及應(yīng)用，國表里一些研究機(jī)構(gòu)已開始研究利用基因芯片對(duì)中藥(材)舉行區(qū)分8，9。接納基因芯片

4、技能斷定中藥的根本歷程是10：應(yīng)用分子生物學(xué)技能尋出待斷定中藥的特定寡核苷酸序列；以此寡核苷酸序列作為探針，裝配到芯片上；檢測樣品DNA的提娶擴(kuò)增和標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟；雜交檢測及結(jié)果闡發(fā)。此中尋出待定中藥的特定DNA序列DNA探針是創(chuàng)立中草藥斷定基因芯片的關(guān)鍵。本文結(jié)合比年來中藥及別的物種區(qū)分芯片研究希望總結(jié)了幾種可用于中草藥特異性DNA片斷挑選的要領(lǐng)，并對(duì)這些要領(lǐng)的上風(fēng)和不敷做出評(píng)價(jià)。1利用現(xiàn)有藥用植物基因資源挑選其特異性片斷這種要領(lǐng)簡樸、快捷，充實(shí)利用了現(xiàn)有的基因資源。如今許多微生物檢測探針11,12及植物DNA探針13都是按照已公然的基因序列方案的。然而，對(duì)付大多數(shù)藥用植物種類，其遺傳配景很不

5、明晰。已注冊(cè)的藥用植物DNA序列的數(shù)目相對(duì)付總的藥用植物資源非常有限，而且這些序列中大多會(huì)合在少數(shù)植物種類14，以是，這種要領(lǐng)只得當(dāng)于遺傳配景比力明晰或已有相干序列公布的藥用植物。2通過構(gòu)建的DNA文庫挑選這種要領(lǐng)要求先構(gòu)建DNA克隆文庫或DNA文庫，然后從文庫中隨機(jī)選出多少克隆，將各克隆插入片斷斑點(diǎn)印跡在雜交膜上(如硝酸纖維膜、尼龍膜)，用標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的本種基因組和其他種基因組的總DNA為探針別離舉行斑點(diǎn)雜交，選擇與本種基因組雜交時(shí)雜交信號(hào)強(qiáng)，而與其他基因組雜交時(shí)無雜交信號(hào)的克隆，該克隆的插入序列即為本種基因組的特異序列。這種要領(lǐng)可以一次挑選大量克隆，能得到相稱數(shù)目的探針，重要題目是構(gòu)建DN

6、A庫歷程比力繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，文庫質(zhì)量也會(huì)影響挑選結(jié)果。再是假設(shè)從DNA文庫中挑選，因DNA是切除了內(nèi)含子的DNA序列，而許多內(nèi)含子自己在種間具有高度多態(tài)性如rDNA中IST序列，這些序列的切除會(huì)低落種特異性探針的挑選服從。3從nrDNA挑選因布局和成效上的差異，植物基因組差異部位的序列變異速率很不同等，一樣平常環(huán)境編碼區(qū)比力守舊，而非編碼區(qū)序列因其成效上的限定較少,比編碼區(qū)表示出更快的進(jìn)化速率，差異種間各編碼序列或非編碼序列的變異方法和速率也是千差萬別。植物細(xì)胞核中編碼rRNA的基因分編碼區(qū)和非編碼區(qū)，此中編碼區(qū)的18S與5.8S，5.8S與26S基因間被兩個(gè)非編碼區(qū)ITS1和ITS2所隔斷如

7、圖1所示。它們配合構(gòu)成一轉(zhuǎn)錄單元順反子(istrn)，順反子高度重復(fù)(幾百至幾千次),以串聯(lián)的方法擺列于核染色體上,而且這些核糖體RNA順反子拷貝表示出高度的均一性(hgenEity)18。據(jù)此特性，可按照守舊區(qū)序列方案引物，擴(kuò)增出易變異區(qū)DNA片斷，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測序闡發(fā)后，從中挑選出可做為種特異性探針的寡核苷酸序列19。3.1ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄隔斷區(qū))高等植物中nrDNA序列差異重要表示在ITS、ETS及IGS等非編碼區(qū)上。被子植物中ITS序列既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的守舊性。有研究表白18：被子植物大多數(shù)科屬其ITS序列的種間差異值為1.2%10.2%，屬間差異值為9.6%28

8、.8%，這對(duì)體系發(fā)育研究來說都是較符合的范疇，也得當(dāng)從這些序列中挑選種特異性探針。ZhangYB等20將16個(gè)差異種屬石斛的ITS1-5.8S-ITS2序列結(jié)實(shí)于玻片上制作了基因芯片，并用熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的ITS2序列作為探針,可檢測出5種已被載入?中國藥典?的石斛。該基因芯片還可檢測出含有9種差異的中藥材復(fù)方中的石斛。劉建全等21從市售“藏茵陳藥材中提取DNA,PR擴(kuò)增ITS1-5.8SrDNA-ITS2整個(gè)片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序得到約700bp片斷，接納排序和體系發(fā)育闡發(fā)軟件闡發(fā)“藏茵陳原植物的親緣干系，據(jù)此方案的特異性分子快速斷定試劑盒可對(duì)市場上的藏茵陳舉行檢測。3.226SrDNAnr

9、DNA編碼區(qū)比力守舊，但此中有些可變區(qū)，差異的植物類群，其可變區(qū)變異率有很大差異。對(duì)付變異率大的類群，可以據(jù)此從中挑選到區(qū)分DNA探針。為了對(duì)差異種的貝母舉行區(qū)分，香港都會(huì)大學(xué)及香港理工大學(xué)的研究者22方案了一種基因芯片可有用地對(duì)差異種的貝母舉行區(qū)分。他們起首提取9種貝母球莖的基因組DNA，用引物對(duì)(上游引物5-GAGTGGGTTGTTTGGGA-3；卑劣引物5-GTATTGAGGGAAATT-3)對(duì)其26SrDNA基因D2與D3區(qū)舉行擴(kuò)增和測序，從其多態(tài)性區(qū)段方案了種種屬特異性寡核苷酸探針，然后將差異種屬寡核苷探針點(diǎn)置于經(jīng)多聚賴氨酸處置懲罰包被的芯片。用來自差異種貝母的熒光素標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的P

10、R產(chǎn)物與DNA芯片舉行雜交，可在芯片特定位置檢測到差異種貝母的熒光信號(hào)從而到達(dá)區(qū)分差異貝母的目的。陳月琴等23從采自陜西秦嶺和廣東天然庇護(hù)區(qū)的杜仲中提取總DNA，PR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒載體PTZ19毗連，Sanger停頓法測定26SrDNA片斷，接納盤算機(jī)闡發(fā)軟件Pgene610比力了金縷梅、栓皮櫟、水青樹、領(lǐng)春木及前人測定的8蒔植物的同源序列，尋出其特性性核苷酸序列，為進(jìn)一步開展杜仲的埋頭性核酸分子探針研究奠基基矗從上述例子可以看到有些探針的是從rRNA編碼區(qū)基因挑選出來，因這些區(qū)段的守舊性，在差異品種間的變革比力有限，難于挑選到有較大差異的長探針，對(duì)有些類群的植物乃至難于見效，如需區(qū)分的種類較

11、近緣時(shí)，從非編碼區(qū)挑選大概會(huì)得到更好的結(jié)果。4從葉綠體DNAatK，trnL基因挑選如今常用于生藥闡發(fā)的葉綠體基因組中的基因片斷有核酮糖-1,5-二磷酸酯羧化酶基因(rbL)，編碼成熟酶基因(atK)，編碼RNA聚合酶B亞基基因(rp)，編碼tRNA-lysine基因(trnL)，編碼核糖體大亞基卵白16基因(rpl16)，編碼核糖體小亞基卵白4基因(rps4)等26。此中atK基因在葉綠體基因組中的全部編碼卵白基因中進(jìn)化速率最快，常被用來研究被子植物科內(nèi)程度的近緣干系研究中。再就是trnL基因，trnL基因內(nèi)有三段非編碼區(qū)，由于不受成效的限定，其進(jìn)化速率大于成效編碼區(qū)，如今被普及用于植物體系

12、學(xué)研究，也可以作為種特異性探針挑選的目的區(qū)段。如今還未見從葉綠體基因中挑選中藥區(qū)分探針的報(bào)道，但應(yīng)用其相干序列舉行區(qū)分的事例許多，如章群27運(yùn)用PR產(chǎn)物直接測序法測定杜仲原植物atK基因序列，通過lustal軟件將其與GenBank中同源序列舉行排序比力，創(chuàng)造32個(gè)特異性位點(diǎn)和一個(gè)杜仲所獨(dú)占的GA插入序列，結(jié)論以為atK基序列的測序闡發(fā)可成為杜仲正品斷定的有用本領(lǐng)。5從差減DNA克隆庫中挑選按捺差減雜交法是Diathenk等28所創(chuàng)立，最初是應(yīng)用于創(chuàng)立差異DNA文庫，它是一種在差減DNA和RDA的底子上生長起來的基于PR的差異基因表達(dá)挑選要領(lǐng)。其根本原理是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，比鏈間退火更

13、不變，從而使非目的序列片斷兩頭反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生雷同于“鍋柄的布局，無法與引物配對(duì)，從而選擇性地按捺了非目的片斷的擴(kuò)增，而差異片斷得到富集。李同祥29利用該要領(lǐng)舉行石斛區(qū)分DNA探針的挑選其歷程見圖2。起首得到兩種石斛之間差減片斷，然后選部門差異片斷克隆別離和全部實(shí)行石斛的總DNA雜交，從中挑選出能與同種石斛DNA雜交而與別的種DNA不克不及雜交的克隆作為該種石斛專屬DNA探針，將這些探針點(diǎn)在尼龍膜上制成微陣列，可敏捷而快速地區(qū)分出迭鞘石斛(D.aurantiauKerr)，金釵石斛(D.nbileLind.)，鐵皮石斛(D.finaleKiuraetig)，鼓糙石斛(D.hrystxu

14、Lindl.)，流蘇石斛(D.fibriatuHk)。因按捺差減雜交法的挑選目的基因是整個(gè)基因組，以是可以得到大量的探針，而且可以得到長堿基序列的探針，選擇更近緣的種做為Driver有利于進(jìn)步差減克隆中種特異性探針的比例，從而進(jìn)步挑選服從，不敷之處是歷程比力龐大，各步調(diào)反響條件難于掌握。6利用RAPD、AFLP分子標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟構(gòu)建探針RAPD、AFLP分子標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟不單可以直接用來舉行中藥材的區(qū)分和藥材道地性斷定如Sha等30用RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物能有用地區(qū)分人參、西洋參、三七及其偽品；胡珊梅等31用RAPD技能探究澤瀉道地藥材與非道地藥材之間遺傳變異的巨細(xì)，并創(chuàng)立了道地藥材的品格斷定要領(lǐng)，還可

15、以通過接納RAPD，AFLP多態(tài)性產(chǎn)物，克隆后作為RFLP探針32或作為挑選人工染色體文庫(BA、YA文庫)的特異性探針33，或?qū)Χ鄳B(tài)性產(chǎn)物舉行測序，方案特異性引物探針34，用于中草藥的區(qū)分。此要領(lǐng)涉及4個(gè)步調(diào):DNA抽提；RAPD或AFLP擴(kuò)增；特異性條帶的接納測序；探針的方案和驗(yàn)證。莊南生等35應(yīng)用AFLP標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟技能得到了甘蔗祖親種的AFLP特異片斷478條，對(duì)此中部門AFLP特異片斷通過斑點(diǎn)雜交和Suthern雜交闡發(fā)，挑選出了5個(gè)甘蔗屬特異性探針，2個(gè)斑茅特異性探針。通過RAPD或AFLP的要領(lǐng)不方案引物，要領(lǐng)上比力簡樸省事，但得到的探針數(shù)目有限，許多環(huán)境難以得到探針。綜上所述，中藥區(qū)分種特異性探針可以從多種途徑得到，可以按照特定的方案選擇有用的挑選途徑。必要指出的是某DNA同源區(qū)段具多態(tài)性并不代表能從此中挑選出