標(biāo)準(zhǔn)病理組織制片和染色技術(shù)

1、標(biāo)準(zhǔn)病理組織制片和染色技術(shù)第1頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四一、前 言 病理組織制片和染色技術(shù)是病理學(xué)的重要組成部分，病理的教學(xué)、科研、臨床活檢、尸解檢驗(yàn)、診斷等都離不開制片染色技術(shù)工作。因此，組織的制片和染色技術(shù)是研究病理學(xué)的重要的方法和手段之一。 第2頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 近年來病理技術(shù)不斷發(fā)展，如特殊染色、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)（免疫熒光組織化學(xué)、免疫酶組織化學(xué)）細(xì)胞培養(yǎng)、原位分子雜交、放射自顯影、原位PCR技術(shù)等在廣泛的應(yīng)用和提高，大大促進(jìn)了病理學(xué)科的發(fā)展，把病理學(xué)推進(jìn)了一個(gè)新的領(lǐng)域，但這些新技術(shù)也都建立在病理組織制

2、片或染色基礎(chǔ)上，所以要認(rèn)識(shí)制片和染色技術(shù)的重要性，不但要學(xué)習(xí)新技術(shù)，更要掌握這一傳統(tǒng)的病理技術(shù)，共同推向病理學(xué)科的發(fā)展。 第3頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 組織制片技術(shù)的應(yīng)用，從1665年由Hook發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始已300多年歷史，最早應(yīng)用冰凍切片隨后又發(fā)展了石蠟切片，后來又利用明膠、火棉膠、碳蠟（聚乙二醇）、塑料、包埋組織而制作切片。 第4頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 從而觀察不同的組織、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以及細(xì)胞內(nèi)某些化學(xué)成份含量變化。 第5頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 各種組織制片成切片標(biāo)本，須要經(jīng)

3、過一個(gè)比較繁多的過程，現(xiàn)將制作切片的主要程序和制片的種類，介紹： 第6頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、烤片、脫蠟、各級(jí)酒精、水洗、常規(guī)染色、脫水、透明、樹膠封固。石蠟制片程序第7頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四冰凍制片程序 組織取材、冰凍切片、干燥粘片、固定、染色、脫水、透明、樹膠封片。第8頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四非切片 （了解內(nèi)容）1 整體封藏法低等動(dòng)物自身薄片如：魚鱗片、蛙胚。2 涂片法如：血液、精液、痰、胸腹水等3、磨片法主要用有鈣鹽堅(jiān)硬材料，

4、牙齒、介殼、堅(jiān)骨手工磨4 分離法a、壓片法動(dòng)終板的制備b、撕碎法c壓碎法第9頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四二、取材（實(shí)驗(yàn)病理、臨床病理、尸解診斷）第10頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四1、實(shí)驗(yàn)病理取材動(dòng)物的殺死：動(dòng)物殺死方法很多，根據(jù)動(dòng)物大小、種別、觀察目的而定。 第11頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四A：斷頭法：青蛙、小鼠等較小的動(dòng)物B：空氣栓塞法：兔貓（2040ml） 狗100mlC：麻醉法：乙醚、氯仿、4%巴比妥 作V注射1ml/1kg，20%氨基甲酸 乙酯（尿烷）作腹腔注射5ml /1kg D：擊頭法

5、：大鼠 第12頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 E：放血法：眼球放血（小鼠）股動(dòng)脈放血，大動(dòng)物：牛、豬 原則：要盡避免使動(dòng)物長時(shí)間陷入痛苦和瀕于死亡狀態(tài)，以免疫組織成份，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起病理假象。 第13頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 (1)取材時(shí)所用的刀要銳利，動(dòng)作仔細(xì)， 不可來回切割，勿使組織受擠壓。 (2)注意組織，器官的切面： 腎臟縱切 腦（表面和腦溝成直角）垂直切 肝脾橫縱均可第14頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 （3） 保持組織清潔：血液，污物， 粘液，食物用生理鹽水洗凈。（4） 保持標(biāo)本新鮮

6、：動(dòng)物死后立 即固定。 (5) 切取組織大?。?0.50.50.2cm 1 1 0.3cm 1.51.50.5cm 第15頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四2 . 臨床活檢取材： 注意事項(xiàng)：（1）申請(qǐng)單位姓名與標(biāo)本一致，防止混亂差錯(cuò)。（2）檢查標(biāo)本是否符合要求干涸壞變，固定液 多少。（3）取材時(shí)描寫：大小，形態(tài)，色澤，硬度等。（4）芝麻或針帽大小組織染伊紅？：鏡紙 包好（5）常見腫瘤取材方法：略。第16頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四3. 尸體解剖組織（臟器）取材：略。第17頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四三固定

7、（ fixalion） 固定：新鮮組織浸泡在適宜的化學(xué)試劑內(nèi)借助于化學(xué)試劑的作用，使組織或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝聚，沉淀，成為溶性并保持組織細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)：稱為固定。所使用的化學(xué)試劑配成的溶液，稱為固定液。 第18頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四1. 固定的目的(1) 迅速防止組織細(xì)胞死后自溶和腐敗 （組織失氧釋放溶酶體酶溶解組織） (2) 固定或沉淀細(xì)胞內(nèi)或組織液中蛋白，脂 肪，糖原，無機(jī)鹽和色素，使其不被溶 解和消失。(3) 使組織硬化，有一定彈性抵抗以后的 脫水，透明，使組織發(fā)生扭曲，變形。 第19頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 (4

8、) 某些傳染性標(biāo)本，能防止疫病的擴(kuò)散。 （如結(jié)核等） (5) 保存細(xì)胞內(nèi)固有的物質(zhì)：如包含體，線 粒體，溶酶體等。 (6) 可增強(qiáng)染色作用 (7) 有利于各種細(xì)胞折光率。 (8 ) 固定后能產(chǎn)生良好的反差。 第20頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 2、固定的注意事項(xiàng)： (1) 必須及時(shí)固定：夏天4h冬天24h就自溶。 (2) 固定液的用量：標(biāo)本體積1015倍。 (3) 固定時(shí)間：根據(jù)組織不同的種類、性質(zhì) 大小、固定液的種類而定。 (4) 固定用的容器要足夠大，一般標(biāo)本缸， 廣口瓶第21頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四4、固定液的分類、配制

9、和特性 （1）分類A：凝固性酒類、丙酮、氯化汞等非凝固性甲醛、戌二醛等B：醛類甲醛、戌二醛氧化劑類重鉻酸鉀、高猛酸鉀蛋白質(zhì)變性酒精、苦味酸C：單純固定液-10%甲醛 95%乙醇混合固定液-Boons Conroys 第22頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四(2)常用固定液的配制及性質(zhì)：A：10%甲醛-應(yīng)用廣泛 (注：36-40%作為活檢、 尸解、一般形態(tài)學(xué)觀察常用)優(yōu)點(diǎn)：刺激性氣味、對(duì)組織滲透力強(qiáng)、固定均 勻、能保存脂類（神經(jīng)、髓鞘、高爾基體、 線粒體、糖類保存）價(jià)格便宜、配制簡單、 使用方便。缺點(diǎn)：固定久產(chǎn)生色素 圖附 第23頁，共121頁，2022年，5月20日，

10、22點(diǎn)55分，星期四10%中性甲醛(ph7.3-7.6)濃甲醛100ml自來水900ml (組織化學(xué)、免疫組化、保存抗原)10%中性緩沖甲醛(ph7.0)濃甲醛100ml 蒸餾水900mlNaH2 po4H2o 4gNa2Hpo4 6.5 第24頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 B： 酒精優(yōu)點(diǎn)：固定又脫水：保存糖原，尿酸鹽。 （脫落細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞也常用）缺點(diǎn)：滲透力強(qiáng)-組織表層固縮 第25頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四C：丙酮：用于酸的固定(磷酸酶、 胰酶、氧化酸) 收縮劇烈，揮發(fā)、易燃、與水、 醇、氯仿、醚混合 第26頁，共121頁，

11、2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四混合固定液FAA：濃甲醛100ml95%酒精850ml 冰醛醋58ml(收縮小、核染色質(zhì)固定好)Boulns液：苦味酸飽和液75ml 濃甲醛 75ml 冰醋酸 5ml (對(duì)組織收縮小，固定均勻、保存細(xì)微結(jié)構(gòu)、軟化皮膚、肌健、結(jié)締組織較好 ) 第27頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四3、固定的原理甲醛為例，甲醛與組織蛋白反應(yīng)是多樣而復(fù)雜的。PCONH+HCH+P-CONHOP-CON-C-P-CONHH亞甲基橋肽鍵甲醛蛋白質(zhì)分子之進(jìn)行交換，形成亞甲基橋，把蛋白質(zhì)分子串聯(lián)起來，使蛋白變性，破壞了蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，達(dá)到固定目的。第

12、28頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四四、洗滌 組織在固定后，一定要把滲透到里面的固定液(沉淀物或結(jié)晶)洗去，然后再進(jìn)行下一步程序，洗滌必須徹底，否則留在組織中的固定液有可能妨礙染色。 第29頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四洗滌的原則：1、固定液為乙醇或酒精混合液一般不要 沖洗。2、固定液為水配制者，用水流水沖洗3、凡含有鉻酸、重鉻酸鉀的固定液-洗滌4、含有苦味酸用乙醇配制的固定液-洗滌第30頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四5、含有氯化汞固定液-沖洗-碘液去 汞(zenkers)-5%硫化硫酸鈉去碘6、洗滌時(shí)間大

13、動(dòng)物組織8h以上、 小動(dòng)物組織2-8h洗滌方法：流水沖洗 第31頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四五、脫 水脫水就是利用某些化學(xué)試劑與水混合內(nèi)的水份徹底脫除。要求：1、脫水劑能與水任何比例混合 2、脫水劑也能與透明劑混合 3、脫水要徹底否則無法進(jìn)行透明 4、低濃度-高濃度循序進(jìn)行(酒精是依次遞增、水是級(jí)差遞減)常用的各級(jí)酒精梯度，達(dá)到脫水目的【60% 70% 80% 90% 100% I 100% 】 第32頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四乙醇結(jié)構(gòu)式CH3 CH3 OH水的結(jié)構(gòu)式H2OH-O H-O H-O H-O H-HRHR乙醇的羥基（

14、OH）和水形成氫鍵，水分子與乙醇分子逐步締合在一起。乙醇與水相混容的原理：第33頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四常用的脫水劑 1、 酒精：特點(diǎn)：能力強(qiáng)，使組織硬化，和二甲苯互溶。缺點(diǎn)：使組織收縮，變脆。2、 丙酮：比酒精脫水強(qiáng)，收縮厲害。臨床病理用于快速脫水3、 二氧陸環(huán)：有毒性，既脫水又透明使組織收縮小不硬化4、 正丁醇：有毒性，既脫水又透明皮膚、骨 叔丁醇發(fā)松子醇5、 脫水時(shí)間：根據(jù)組織大小、類別、種屬、分別安排第34頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四六、透明(clearing) 組織經(jīng)脫水后，不能直接浸入石蠟中，還要一個(gè)媒劑透明過程。

15、透明劑既可與脫水劑相混合又能和石蠟相混合，起到橋梁作用，當(dāng)組織中全部被透明劑點(diǎn)有時(shí)，光線可以透過呈現(xiàn)透明狀態(tài)-稱組織透明。 第35頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四常用的透明劑 1、 二甲苯：易揮發(fā)、易燃、透明力強(qiáng)、收縮、變脆(能與無水乙醇相混合，又能與石蠟相混合，作兩組透明。)2、 氯仿：比二甲苯透明力強(qiáng)，不收縮、變脆。時(shí)間長24h，收縮小3、 苯：甲苯和二甲苯相同。易揮發(fā)、易燃、有毒性香柏油 第36頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四苯甲酸甲酯-收縮小、時(shí)間1224h，常用為火棉膠切片 俄甘油苯酚第37頁，共121頁，2022年，5月20日

16、，22點(diǎn)55分，星期四透明時(shí)間：眼觀組織呈透明狀態(tài)小組織 10min中組織 20-40 min大組織 1-2h(如果組織不透明1、脫水未盡2、組織太厚3、時(shí)間不夠)第38頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四七、浸蠟（Infilftrition） 組織經(jīng)過媒劑的透明作用后，移入熔化的石蠟內(nèi)浸漬稱為浸蠟。 第39頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四、 石蠟：切片蠟_軟蠟50以下，酶，保存抗原活性(純度高密度好) 硬蠟50以上-6264工業(yè)石蠟_質(zhì)地較差，價(jià)格便宜 純度低，熔點(diǎn)不準(zhǔn)確2、根據(jù)組織的不同選用：6062-皮膚、骨組織、硬纖維瘤58以下-作免

17、疫組化酶 第40頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四3、恒溫箱溫度一般高于石蠟熔點(diǎn)454、浸蠟可分三級(jí) 軟蠟 54-56 硬蠟 58-60 硬蠟 6062第41頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四5、脫水、透明、浸蠟時(shí)間表小動(dòng)物組織（鼠）脫水、透明和浸蠟時(shí)間表程序項(xiàng)目時(shí)間分配75%乙醇時(shí)間長短均可85%乙醇 25h95%乙醇 25h95%乙醇 25h無水乙醇20min 無水乙醇30min無水乙醇30min二甲苯15min二甲苯30min 二甲苯 30min石蠟5658 30min石蠟5658 30min 石蠟6062 12h第42頁，共121頁，

18、2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四5、脫水、透明、浸蠟時(shí)間表外檢組織脫水、透明和浸蠟時(shí)間表程序項(xiàng)目時(shí)間分配85%乙醇時(shí)間長短均可95%乙醇 12h95%乙醇 12h95%乙醇 12h無水乙醇12h 無水乙醇12h無水乙醇12h二甲苯1h二甲苯 12h 二甲苯 12h石蠟5658 12h石蠟5658 12h 石蠟6062 24h第43頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四5、脫水、透明、浸蠟時(shí)間表尸體解剖組織脫水、透明和浸蠟時(shí)間表程序項(xiàng)目時(shí)間分配75%乙醇時(shí)間長短均可85%乙醇 510h95%乙醇 510h95%乙醇 510h無水乙醇25h 無水乙醇25h無水乙醇

19、 25h二甲苯30min左右二甲苯12h 二甲苯 12h石蠟5658 12h石蠟5658 12h 石蠟6062 24h第44頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四5、脫水、透明、浸蠟時(shí)間表大動(dòng)物組織脫水、透明和浸蠟時(shí)間表程序項(xiàng)目時(shí)間分配75%乙醇時(shí)間長短均可85%乙醇 25h95%乙醇 25h95%乙醇 25h無水乙醇30min 無水乙醇30min無水乙醇 12h二甲苯30min二甲苯30min 二甲苯 1h左右石蠟5658 30min石蠟5658 12h 石蠟6062 23h第45頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四八、包埋（Emledding）

20、 組織經(jīng)過固定、脫水、透明、后再用石蠟鑄成蠟塊稱包埋。 1. 埋石蠟的要求：(1)盡可能和浸蠟熔點(diǎn)一致(2)南方：5862 北方：5258 2. 方法： 第46頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四 3. (1) 最大平面向下壓平 (2) 管狀 束壁 皮膚 豎埋 (3)包埋石蠟溫度高于石蠟熔 點(diǎn)57 (4)石蠟?zāi)毯蟠蜷_蠟框修整 蠟塊 (5)貼好標(biāo)簽 第47頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四九、石蠟切片法 1.切片前的準(zhǔn)備工作：(1)切片機(jī)A：輪轉(zhuǎn)切片機(jī) B：平推式切片機(jī)(2)刀片(刀) 一次性刀片或切片刀(磨刀)(3)清潔的載玻片(4) 甘蛋白

21、油、白膠、毛筆、鈣子 第48頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四2. 切片制作過程(實(shí)習(xí)) 注意事項(xiàng)：a) 切片厚度：5um(鏡下46um)b) 刀片要鋒利否則會(huì)出現(xiàn)卷片、起皺、不連 結(jié)、破碎不完整。c) 刀與組織的角度46d) 各個(gè)部件，螺絲應(yīng)旋緊否則震動(dòng)切片厚薄 不均。第49頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四一、染色的目的 病理學(xué)的各種切片，都必須應(yīng)用一種以上的染料通過不同的方法將切片的各種不同的組織結(jié)構(gòu)給予顯示出來，以利于鏡下辨別其各種不同的形態(tài)，做出正確的診斷。十、染色第50頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四二

22、、染色的作用 1、化學(xué)作用： 染液中的陰陽離子與組織中的陰陽離子相互作用所完成的染色。染液中有酸性和堿性染料之分，酸性染料有染色作用的部分是陰離子，而堿性染料有染色作用的部分則是陽離子。組織的各種細(xì)胞中細(xì)胞核為酸性，它可與蘇木素液中的陽離子發(fā)生反應(yīng)。細(xì)胞槳中的陽離子則與伊紅液中的陰離子發(fā)生反應(yīng)，完成染色。第51頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四2、物理作用：染料通過浸透，分散浸入到組織的間隙中，因受分子的引力作用，染液中的色素粒子被吸附而完成染色過程。3、染色方法應(yīng)用于常規(guī)病理切片的染色方法稱為普通染色法或HE染色法，而用特別的染色法則稱為特殊染色法。第52頁，共12

23、1頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四1、二甲苯 510min 2、二甲苯 510min 3、無水酒精 30se1min 4、無水酒精 30se1min 5、95%酒精 30se1min 6、95%酒精 30se1min 7、90%酒精 30se1min 8、80%酒精 30se1min 9、Harris蘇木素 10se15min 10、自來水洗 30sec1min 11、1%鹽酸酒精 30sec 12、流水沖洗1015min或溫水洗 510min 13、1%伊紅染色 25min 14、80%乙醇洗去多余的染色 1min 15、90%酒精 301min 16、95%酒精 301mi

24、n 17、95%酒精 301min 18、100%酒精 301min 19、100%酒精 301min 20、石碳酸二甲苯 1min 21、二甲苯 1min 22、二甲苯 1min 23、二甲苯 1min 24、中性樹膠封固 HE染色法程序第53頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四結(jié)果：細(xì)胞核：藍(lán)色，軟骨基質(zhì)鈣鹽等深藍(lán)色；細(xì)胞漿深淺不同的粉紅色，嗜酸性顆粒鮮紅色；膠原纖維呈粉紅色，肌纖維呈鮮紅色，彈力纖維呈亮紅色，紅血球?yàn)榻奂t色，蛋白基質(zhì)為粉紅色。第54頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四染色時(shí)的注意事項(xiàng)（1）切片烘烤以切片附貼牢固為原則，否則容

25、易掉片。（2）切片脫蠟一定要徹底，不然會(huì)導(dǎo)致染色深淺不一。（3）切片染蘇木素前可令其無水化，這樣可延長蘇木素的壽命。因?yàn)槊看稳旧?，切片水洗，然后進(jìn)入染液雖然每次帶入的水分很少，但隨著次數(shù)的增加，所帶入的水分足可以稀釋染液影響染色的質(zhì)量。第55頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（4）切片在蘇木素的染色時(shí)間應(yīng)充分寧過勿不足。對(duì)于初學(xué)者來說更應(yīng)過染，否則分化會(huì)過度導(dǎo)致染色過淺。（5）切片分化時(shí)，要根椐不同的組織來確定分化時(shí)間，并不斷積累經(jīng)驗(yàn)。（6）伊紅染色時(shí)間也要充分，經(jīng)低濃度灑精時(shí)應(yīng)仔細(xì)觀察，必要時(shí)快速通過，以免過于褪色。第56頁，共121頁，2022年，5月20日，2

26、2點(diǎn)55分，星期四（7）切片致無水酒精后，不要在控干無水酒精時(shí)讓切片干涸，可以不經(jīng)控干直接地進(jìn)入碳酸二甲苯（也可以進(jìn)入二甲苯酒精混合1：1）碳酸有較強(qiáng)的吸水性透明也好很適合南方地區(qū)。（8）切片從二甲苯中取出封固時(shí)，切不能讓其干涸，因南方地區(qū)空氣潮濕干涸的切片與空氣接觸，可吸收其水份。這樣的切片很容易裉色。切片不干涸，表面被著二甲苯，由于它不溶于水起到與水隔絕的作用。第57頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（9）滴中性樹膠封蓋切片，膠不能太濃，太濃膠難以均勻鋪開，且易產(chǎn)生氣泡，又不能太稀過稀的膠由于二甲苯含量較多，當(dāng)切片干燥時(shí)，二甲苯揮發(fā)掉，膠封的切片收縮，即可導(dǎo)致一半

27、切片沒有被膠封固的結(jié)果。最合適的膠應(yīng)是滴下成珠。第58頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（10）封固切片時(shí)，盛膠的瓶子及瓶蓋四周不要留有余膠，否則瓶蓋難以打開。因此每次用完后都必須將其擦干凈。當(dāng)打不開瓶蓋時(shí)應(yīng)放入烤箱中烘烤，即可打開。 （11）標(biāo)簽附貼要認(rèn)真，不要貼得歪歪斜斜，影響切片的外觀.第59頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四染液的配制(一）蘇木素的配制1、蘇木素的種類：A、明礬蘇木素（Harris,Mayer,Ehrlich）B、鐵蘇木素（Wiegert,Heidnhain）C、鎢蘇木素（PTAH）D、鉛蘇木素（Soecia）第60頁

28、，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（1）Harris蘇木素的配制（Harris.l900）蘇木素 0.5g無水乙醇 5ml鉀明礬（硫酸鋁鉀） 10g蒸餾水 100ml氧化汞 0.25g冰醋酸 4ml第61頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四預(yù)先把蘇木素溶于無水酒精中配制時(shí)，取一三角瓶倒入蒸鎦水，再加入鉀明礬，于電爐上加熱至90左右時(shí)，拔去電源加入酒精蘇木素，再插上電源繼續(xù)加熱，持續(xù)35分鐘，拔去電源，加入氧化汞，此時(shí)可產(chǎn)生大量的氣泡，應(yīng)防止其溢出瓶外。再繼續(xù)通電加熱，煮沸后持續(xù)35分鐘，此時(shí)溶液表面看呈深紫黑色，即可撤離電源，用備好的冰涼水，將燒

29、瓶迅速的插入水中，讓染液迅速冷卻，中止氧化放入暗處。于第二天過濾后再加入冰醋酸，即可使用，染色時(shí)間515分鐘。第62頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（2）Mayer氏蘇木素（Mayer,1903）蘇木素 0.1g蒸鎦水 100ml鉀明礬 5g檸檬酸 0.1g水合醛 5g碘酸鈉 20mg第63頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四將蒸包餾水稍為加溫，加入蘇木素不停地?cái)嚢柚敝寥芙?，再加入鉀明礬，令其溶解后再加入碘酸鈉過濾后即可使用，染色時(shí)間1020分鐘，如果先用天表藍(lán)為媒染劑，染色時(shí)可在23分鐘。第64頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)

30、55分，星期四配制蘇木素的注意事項(xiàng)1、蘇木素可以配成5%或10%，讓其氧化產(chǎn)生蘇木紅，然后根椐每次配制溶液的量，再?zèng)Q定加入多少。2、在配制蘇木素時(shí)，三角燒瓶的選擇也很重要，例如，配制500ml 的溶液，應(yīng)選用15002000ml的三角燒瓶，配制1000ml則可選3000ml的燒瓶，這樣溶液在加入氧化汞時(shí)，才不會(huì)噴出瓶外。第65頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四3、冰醋酸一定要在溶液過濾后加入如果過濾前加入，則在過濾時(shí)溶液很難通過濾紙，這主要是冰醋酸草可造成對(duì)濾紙的損害。第66頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四(二）伊紅的配制1、1%伊紅灑精的

31、配制 伊紅（水溶） 5g 70%-75%酒精 500ml 取少許蒸餾水來溶解伊紅或稱曙紅，當(dāng)完全溶解后，再加入酒精，然后再加入少許冰醋酸，此時(shí)溶液即可變?yōu)轷r紅色。注意：冰醋酸一定要加進(jìn)去如果沒有加入冰醋酸，細(xì)胞漿將難以染得鮮艷。第67頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四2.切片染完蘇木素后的分化，應(yīng)該如何控制和注意什么問題？（1）分化液中鹽酸不能高于1%，否則會(huì)因分化過強(qiáng)而將已著色的顏色大部分脫水，造成染色過淺。（2）對(duì)各種組織應(yīng)視情況而定，如淋巴結(jié)的切片，應(yīng)分化較長時(shí)間等。（3）分化完后，應(yīng)在顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)核中的物質(zhì)不清楚，則應(yīng)繼續(xù)分化至清晰為止。（4）要認(rèn)真操

32、作，細(xì)心觀察，不斷總結(jié)。第68頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四胃類癌（瘤細(xì)胞小而一致）第69頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四瘤細(xì)胞的多形性第70頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四病理性核分裂像第71頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四平滑肌、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤第72頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四大腸腺體、腺瘤和腺癌第73頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四正常鱗狀上皮、乳頭狀瘤和鱗狀細(xì)胞癌第74頁，共121頁，2022年，5月20日，

33、22點(diǎn)55分，星期四淋巴管轉(zhuǎn)移癌第75頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四肺淋巴管轉(zhuǎn)移癌第76頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四冰凍切片第77頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四一、種類：1、低溫恒冷箱切片法2、二氧化碳冰凍切片法3、甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法4、半導(dǎo)體冰凍切片法5、氯乙烷冰凍切片法第78頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四二、冰凍切片的目的1、在手術(shù)進(jìn)行中。突然發(fā)現(xiàn)病人的病變與原診斷不相符合或者懷疑時(shí)需要病理給予確定。2、了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞或者轉(zhuǎn)移的程度，以利于確定以后

34、的治療措施。第79頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四3、對(duì)于已確定惡性腫瘤的病人則需要了解其手術(shù)范圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤細(xì)胞。4、在剖腹探查所發(fā)現(xiàn)的腫塊。5、顯示組織中的脂肪類物質(zhì)。6、某些酶的顯示如ATP酶琥珀酸脫氫酶等。7、神經(jīng)病理學(xué)中的某些染色法。8、對(duì)某些物質(zhì)所進(jìn)行的免疫熒光的研究。第80頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四三、冰凍切片的操作（1）本室現(xiàn)有Shandon-AS620E型冷凍切片機(jī)的主要性能。左邊的切片臺(tái)可達(dá)到-60左右，冷凍箱內(nèi)在0-30間可任意調(diào)節(jié)，箱面上有電子控制板，裝有急速冷凍，即放上標(biāo)本啟動(dòng)該鍵機(jī)器

35、馬上進(jìn)行冷凍工作并持續(xù)10分鐘；有冷凍臺(tái)溫度顯示冷凍箱內(nèi)溫度顯示；有即時(shí)除霜內(nèi)溫度顯示；第81頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四有即時(shí)除霜鍵，啟動(dòng)該鍵機(jī)器可持續(xù)工作15分鐘，將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉；有照明鍵，啟動(dòng)該鍵可照明工作間；有消毒鍵當(dāng)進(jìn)行一星期的工作后，啟動(dòng)該鍵可對(duì)工作間進(jìn)行消毒；有工作間面的密鎖鍵啟動(dòng)鍵可將工作間鎖住，除此之外該機(jī)的左邊有四個(gè)按鍵兩個(gè)為快速自動(dòng)進(jìn)退、兩個(gè)為微小進(jìn)退、另有一個(gè)手動(dòng)旋鈕，調(diào)節(jié)修塊時(shí)的進(jìn)退。第82頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（2）切片取末經(jīng)固定的組織不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整

36、。最好2424 4mm。（3）取出組織支承器，放平擺好組織周邊滴上包埋劑，速放入冷凍臺(tái)上冰凍，小組織應(yīng)先取一組織支承器滴上包埋劑讓其凍成一個(gè)小臺(tái)再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。（4）將冷凍好的組織塊夾緊于切片機(jī)上修平切面。第83頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（5）調(diào)好厚度，根椐不同的組織而定，一般在5-10um.（6）調(diào)好防卷板，制作冰凍切片的調(diào)節(jié)，關(guān)建在于防卷板的調(diào)節(jié)，這就要求要細(xì)心，準(zhǔn)確，將其調(diào)校，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?，此時(shí)切片。冰凍切片在第一時(shí)間順利地在刀與防卷板之間通過，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板，取一載片，將其附貼上即可。第84頁，共121頁，

37、2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（7）用于附貼切片的載片，不能存放入冷凍的地方，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的溫差，當(dāng)溫度較高的載片附貼上溫度低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子間的彼此轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力。使切片與載片牢固地附貼在一起。如果用冷藏的載片附貼切片，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。第85頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四（8）應(yīng)視不同的組織選擇不同冰凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根椐不同的組織而定，不能一概而論，例如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝臟組織和淋巴結(jié)組織等，冷凍箱的溫度可調(diào)在-10-15左右。切甲狀腺，脾

38、、腎、肌肉等組織,則應(yīng)調(diào)在-15 -20左右。切帶有脂肪的組織如乳腺組織，應(yīng)調(diào)在-25左右，如為大量的脂肪組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30。第86頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四四、冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng)1、防卷板和切片及持刀架上的地方應(yīng)保持干凈經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余及用柔軟的紙張擦。因?yàn)榘駝┏３ＹN在上述的地方。如果不把它們?nèi)コ?，就?huì)影響切片。使切片不能完整切出。2、應(yīng)用于冰凍切片的組織不能過大過厚，過大難以切出好片過厚冰凍費(fèi)時(shí)，最好的取材應(yīng)在24 24 2cm。第87頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四3、冰凍組織前組織放于組織支承器上應(yīng)視組織的走勢

39、來給予放置，然后四周加上包埋劑，保持周邊的整齊，如出現(xiàn)凹凸不平的地方，可用刀子將其修平，才不致于影響切片。第88頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四4、組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液在未能達(dá)到固定前更不能使用。臨床快速冰凍切片不須要預(yù)先固定，一是為了爭取時(shí)間，二是固定了的組織反而增加了切片的難度。如果使用了未完全固定的組織做冰凍切片，就會(huì)出現(xiàn)冰晶，這是因?yàn)楹芤旱墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前，其中的水份也會(huì)滲入到組織當(dāng)中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí)，這些水份就存留于組織中形成了冰晶。第89頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四5、當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)組織冰凍過度時(shí)，可將冰凍的組織取出來，于室溫中停留片刻，以利于軟化組織，使其不致于過度冰凍。第90頁，共121頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)55分，星期四五、冰凍切片的快速染色1、用普通染色進(jìn)行染色（HE染色）（1）固定、切片用電吹風(fēng)吹干后于10%的福爾馬林鹽或純丙酮中固定2分鐘后自來水沖洗。（2）滴少許蘇木素染液