哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)課件

1、關(guān)于哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)第1頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四主要內(nèi)容一、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)二、胚胎干細(xì)胞研究的意義三、胚胎干細(xì)胞研究的歷史與進(jìn)展四 .胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)基本程序五.ES細(xì)胞的保存六.ES細(xì)胞的鑒定七.ES細(xì)胞技術(shù)目前存在的問(wèn)題八.ES細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展方向第2頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四干細(xì)胞功 能 組織發(fā)生 全能干細(xì)胞 多能干細(xì)胞 專(zhuān)能干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞 組織干細(xì)胞 干細(xì)胞分類(lèi) 第3頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四全能干細(xì)胞Totipotent stem cells 具有無(wú)限分化潛能的細(xì)胞?？梢苑?/p>

2、化成人體的各種細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成人體的各種組織器官，如胚胎干細(xì)胞。 八細(xì)胞階段第4頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四多能干細(xì)胞Multipotent stem cells 具有可分化出一種器官的多種組織潛能的干細(xì)胞，即能夠形成兩種或兩種以上類(lèi)型細(xì)胞的干細(xì)胞。具有自我增殖和分化兩種功能。 骨髓造血干細(xì)胞就是典型的多能干細(xì)胞，移植造血干細(xì)胞治療白血病、再生障礙性貧血等血液疾病。第5頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四專(zhuān)能干細(xì)胞 多能干細(xì)胞進(jìn)一步分化成專(zhuān)能干細(xì)胞，只能分化成某一類(lèi)型的細(xì)胞。又稱(chēng)單能干細(xì)胞。 如表皮干細(xì)胞只能分化產(chǎn)生角化表皮細(xì)胞。 第6頁(yè)，共6

3、9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四胚胎性干細(xì)胞Embryonic stem (ES) Cells 來(lái)自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞或畸胎瘤組織等源于胚胎的干細(xì)胞，其基本特性是具有穩(wěn)定地在體外自我更新、并穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能分化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層范疇的各種類(lèi)型分化細(xì)胞，甚至參與個(gè)體發(fā)育，又稱(chēng)為萬(wàn)能細(xì)胞(Multipotent stem cells )。 第7頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四組織干細(xì)胞 Tissue-specific stem cell 指分布在成年生物體組織中負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織細(xì)胞功能的干細(xì)胞。又稱(chēng)為成體干細(xì)胞(A

4、dult stem cells)。 第8頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四一、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)1.定義哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞（Embryo Derived Stem Cells）又稱(chēng)ES或EK細(xì)胞，是從早期胚胎或胎兒中分離出來(lái)的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面具有分化潛能。第9頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四第10頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四2.來(lái)源： 囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM） 早期胚胎的種細(xì)胞或胎兒的原始生殖細(xì)胞。ICM在胚胎著床前：分化出原始內(nèi)胚層，緊貼著囊胚腔的內(nèi)層生長(zhǎng)，最后發(fā)育為卵黃膜；

5、ICM在胚胎著床后：分化為原始外胚層，進(jìn)一步分化為胚胎的3個(gè)種細(xì)胞層，進(jìn)一步發(fā)育為胎兒。 內(nèi)消呼肝胰（內(nèi)胚層發(fā)育為消化系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，肝臟，胰臟） 外表感神仙（外胚層發(fā)育為表皮，感覺(jué)，神經(jīng)系） 其余的是中胚層第11頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四第12頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四3.細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)具有胚胎細(xì)胞的特性：形態(tài)上細(xì)胞體積較小，但是細(xì)胞核較大，核質(zhì)比高，核仁較大，培育時(shí)呈克隆狀生長(zhǎng)，在功能上具有發(fā)育全能型，能進(jìn)行 人為定向分化。普通細(xì)胞系的特性：在體外培養(yǎng)傳代而不發(fā)生分化，能進(jìn)行冷凍保存和遺傳改造。發(fā)育全能性：第13頁(yè)，共69頁(yè)，2022

6、年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四1）形成畸胎瘤：將ES細(xì)胞接種同源動(dòng)物皮下可形成內(nèi)、中、外三種胚層細(xì)胞。2）形成類(lèi)胚體：將ES細(xì)胞在非黏附底物中懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，形成多種系混雜的集合體ES 細(xì)胞全能性體現(xiàn)在：第14頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四3）直系分化：通過(guò)控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化為某特定種系細(xì)胞。新的ES細(xì)胞建系后在體外生長(zhǎng)時(shí)間越短，產(chǎn)生所有類(lèi)型組織的可能性就越大。4）形成嵌合體：組織和器官的細(xì)胞含有兩個(gè)或兩個(gè)以上基因型構(gòu)建而成的完整個(gè)體，稱(chēng)為基因嵌合體或嵌合體動(dòng)物。將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中，可形成

7、嵌合體。ES細(xì)胞或EG細(xì)胞一旦分化即喪失全能性，難以參與胚胎發(fā)育，形成嵌合體。第15頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四4.功能在滋養(yǎng)層細(xì)胞上或在含有分化移植因子的介質(zhì)中，能維持未分化狀態(tài)，并實(shí)現(xiàn)自我更新，因此可以無(wú)限增殖；在體外，在誘導(dǎo)因子的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞黑色素細(xì)胞等。第16頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四ES細(xì)胞具有種系傳遞（germline transmission）能力，能夠形成嵌合體動(dòng)物（chimeric animal）。 若在體外把ES細(xì)胞注射至另一胚泡

8、內(nèi)，使之與受體胚胎細(xì)胞混合，再移植入假孕受體子宮，可發(fā)育獲得嵌合體（chimeric）。ES細(xì)胞可參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。通過(guò)交配可以分離出帶有ES細(xì)胞遺傳性狀的個(gè)體，這是ES細(xì)胞具有種系傳遞能力的一種證明。第17頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四5、ES細(xì)胞自我更新的分子機(jī)理1、LIF（白血病抑制因子）:ES細(xì)胞表面的有一復(fù)合受體，由低親和性的LIF受體和普通亞基gp130構(gòu)成異源二聚體，LIF與受體結(jié)合后激活Jak酶，通過(guò)對(duì)STAT3的磷酸化激活維持細(xì)胞自我更新的基因。第18頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子oct-

9、4： oct-4是ES細(xì)胞維持多能性和進(jìn)入分化的開(kāi)關(guān)，是DNA特異結(jié)合蛋白，通過(guò)激活或者移植靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，維持ES細(xì)胞的自我更新。在ES細(xì)胞中始終保持一定的水平，表達(dá)量在50150%，才能實(shí)現(xiàn)自我更新和維持多能性。Ni Wa等（2000）研究表明：STAT3和oct-4可能作用于相同的靶基因而相互協(xié)調(diào)維持ES細(xì)胞的功能。第19頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四（3）通過(guò)移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶ERK，維持ES的正常功能：SHP-2能除去酪氨酸上磷酸基團(tuán)，作用于gp130受體的胞內(nèi)區(qū)，使gp130和其他的膜受體收到刺激后ERK被激活。 SHP-2和ER

10、K對(duì)STAT3功能有負(fù)調(diào)控作用，抑制其信號(hào)傳導(dǎo)。第20頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四二、胚胎干細(xì)胞研究的意義1.ES細(xì)胞是研究哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律極有價(jià)值的工具第21頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四2.是研究細(xì)胞分化的理想手段ES細(xì)胞僅在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或添加白血病抑制因子或白細(xì)胞介素-6家族的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)，當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)劑時(shí)可以出現(xiàn)定向分化，如視黃酸誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，DMSO誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞等。通過(guò)研究ES細(xì)胞的分化特點(diǎn)，可揭示細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的路徑，發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)受體，揭示細(xì)胞分化和調(diào)亡的機(jī)理。第22頁(yè)，共6

11、9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四第23頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四3.研究基因功能的首選細(xì)胞由于ES細(xì)胞具有穩(wěn)定的核型，并易于誘捕外源基因，因此進(jìn)行基因敲除或定向插入外源基因的理想細(xì)胞。用遺傳修飾的ES細(xì)胞生產(chǎn)嵌合體或用細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的克隆后代，通過(guò)觀察后代的表型變化，可探明未知基因的生物學(xué)功能和表達(dá)調(diào)控規(guī)律。第24頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四4.是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要方法之一用外源基因轉(zhuǎn)染后，篩選陽(yáng)性細(xì)胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合獲得嵌合體后代，用轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞分化為生殖干細(xì)胞，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物。也可把轉(zhuǎn)化

12、后的ES細(xì)胞作為供體核，用細(xì)胞核移植技術(shù)直接獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第25頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四第26頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四5.ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命第27頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四人類(lèi)面臨的大多數(shù)醫(yī)學(xué)難題,如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、癌癥、老年性癡呆、帕金森病、嚴(yán)重?zé)齻?、脊髓損傷和遺傳性缺陷等疾病組織工程學(xué)、功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)、發(fā)育生物學(xué)新藥開(kāi)發(fā)與藥效、毒性評(píng)估等第28頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四6.可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選細(xì)

13、胞癌變主要是由于正常的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞無(wú)序增殖所致。ES細(xì)胞在正常的培養(yǎng)環(huán)境中能維持穩(wěn)定的核型，是研究致癌物質(zhì)誘發(fā)細(xì)胞癌變機(jī)理的理想材料；在研究新藥過(guò)程中，需要對(duì)藥物的作用機(jī)理和藥效進(jìn)行研究，ES細(xì)胞在體外能分化多種體細(xì)胞，可以直接作為實(shí)驗(yàn)材料來(lái)篩選新藥，可縮短新藥開(kāi)發(fā)周期，且治療的針對(duì)性強(qiáng)。第29頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四三、胚胎干細(xì)胞研究的歷史與進(jìn)展干細(xì)胞研究成為繼人類(lèi)基因組大規(guī)模測(cè)序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命科學(xué)科研究領(lǐng)域；1999年干細(xì)胞研究被美國(guó)SCIENCE雜志評(píng)為1999年度世界十大科學(xué)之冠；2000年干細(xì)胞研究再次被SCIEN

14、CE雜志評(píng)為該年度世界十大科學(xué)成就之一。第30頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四 1981年英國(guó)劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman用延緩著床的胚泡的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM （inner cells mass)獲得鼠的ES細(xì)胞；同年美國(guó)的Maryin用條件培養(yǎng)基獲得鼠的ES細(xì)胞。Roberston用不同品系的鼠胚和具有不同遺傳疾病的胚胎建立了細(xì)胞系并進(jìn)行了多能性和嵌合特性的分析。第31頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四 1998年11月，美國(guó)威斯康星大學(xué)的科學(xué)家James Thomson等從人囊胚的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)中取得胚胎干細(xì)胞。他們把胚胎干細(xì)胞與小鼠的骨髓

15、間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)。結(jié)果表明胚胎干細(xì)胞可以進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的非分化增殖，同時(shí)還保持著分化為滋養(yǎng)層組織及三種胚層組織的能力。這為胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。第32頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四 1999年12月，美國(guó)科學(xué)家在美國(guó)科學(xué)院院刊報(bào)告說(shuō)，小鼠肌肉組織的成體干細(xì)胞可以“橫向分化”為血液細(xì)胞。隨后，世界各國(guó)的科學(xué)家相繼證實(shí)，成體干細(xì)胞包括人類(lèi)的成體干細(xì)胞具有可塑性。2000年5月，日本啟動(dòng)“千年世紀(jì)工程”，以干細(xì)胞工程為核心技術(shù)的再生醫(yī)療成為這項(xiàng)工程的四大重點(diǎn)之一，第一年度投資金額達(dá)108億日元。 第33頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四

16、2001年1月，英國(guó)議會(huì)上院通過(guò)法案，允許科學(xué)家克隆人類(lèi)早期胚胎，并利用它進(jìn)行醫(yī)療研究。 2001年4月，美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，從病人臀部和大腿處抽取的脂肪中，含有大量類(lèi)似干細(xì)胞的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以發(fā)育成健康的軟骨和肌肉等。 第34頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四 2003年，美國(guó)衛(wèi)生獨(dú)立研究院（National Institutes of Health，NIH）華裔科學(xué)家施松濤等人首次發(fā)現(xiàn)牙齒間質(zhì)存在干細(xì)胞。2005年報(bào)出干細(xì)胞研究領(lǐng)域乃至全球?qū)W術(shù)界一大學(xué)術(shù)丑聞：2004及2005年韓國(guó)漢城大學(xué)教授黃禹錫有關(guān)干細(xì)胞研究的論文兩次榮登Science雜志，結(jié)果經(jīng)各方查證證實(shí)其論

17、文數(shù)據(jù)存在造假現(xiàn)象，2006年Science雜志宣布撤回這兩篇論文。 第35頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四 2006年，日本科學(xué)家山中亞彌等成功誘導(dǎo)出鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced Pluripotent Stem Cell， iPS細(xì)胞），此項(xiàng)研究成功將干細(xì)胞研究擴(kuò)充到一個(gè)新的領(lǐng)域：重編程！2007年，iPS研究取得巨大進(jìn)展：山中亞彌等人和湯姆森帶領(lǐng)下的華裔科學(xué)家俞君英等人分別在Cell及Science發(fā)表論文宣布成功利用人類(lèi)上皮細(xì)胞誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。 第36頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四 2008年，美國(guó)科學(xué)家解析了microRNAs

18、在干細(xì)胞發(fā)育及分化中的調(diào)控作用，為干細(xì)胞日后的研究提供了非常重要的參考資料。2009年3月，美國(guó)白頭研究所（Whitehead Institute）科學(xué)家在成功誘導(dǎo)iPS細(xì)胞后，巧妙的將誘導(dǎo)iPS時(shí)帶入細(xì)胞的基因去除，大大降低了細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)。 2009年3月，湯姆森和俞君英帶領(lǐng)的研究小組在iPS研究方面又邁進(jìn)一大步，他們利用質(zhì)粒作為誘導(dǎo)iPS基因的載體進(jìn)行誘導(dǎo)iPS細(xì)胞后，隨著細(xì)胞分裂丟失質(zhì)粒，可以得到純凈無(wú)外源DNA的iPS細(xì)胞，在iPS細(xì)胞應(yīng)用安全性方面又進(jìn)一步。 第37頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四四 .胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)基本程序1.胚胎干細(xì)胞的分離目前ES細(xì)

19、胞主要有兩個(gè)來(lái)源，即胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和生殖嵴中的原始生殖細(xì)胞，前者更為常用。囊胚：盡量選擇體內(nèi)受精的胚胎分離ES細(xì)胞；對(duì)于相同來(lái)源的胚胎選擇色澤透亮，ICM明顯的胚胎。胎兒性腺脊：經(jīng)酶消化后，可直接培養(yǎng)在分化抑制培養(yǎng)體系中，一般7d傳代一次，直至出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)均一的克隆細(xì)胞團(tuán)，挑選后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。第38頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四小鼠多用34天的胚泡或23天的桑椹胚，豬取810天的胚泡，綿羊取89天的胚泡，人和牛取78天的胚泡。第39頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四原始生殖細(xì)胞第40頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四從胚泡中分

20、離出細(xì)胞團(tuán)的方法主要免疫外科學(xué)方法，顯微外科學(xué)方法和組織培養(yǎng)法等。其中組織培養(yǎng)法是將胚泡接種在飼養(yǎng)層上，模擬體內(nèi)胚泡的著床，更接近自然發(fā)育過(guò)程，較易獲得胚胎干細(xì)胞集落。第41頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四（1）免疫外科學(xué)方法：該法的原理是利用囊胚腔對(duì)抗體的不通透性，通過(guò)抗體、補(bǔ)體結(jié)合對(duì)細(xì)胞的作用，去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，保留ICM細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。以小鼠為例，將體外培養(yǎng)的小鼠胚泡去除透明帶后，經(jīng)抗小鼠脾細(xì)胞抗血清作用一定時(shí)間后再移入含新鮮豚鼠血清的培養(yǎng)液中處理，這樣滋養(yǎng)層細(xì)胞即被破壞，去除死去的滋養(yǎng)層細(xì)胞即得ICM，將ICM離散成卵裂球即可接種培養(yǎng)。此法較為簡(jiǎn)單，且去除滋養(yǎng)層細(xì)胞

21、較徹底，最為常用。第42頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四（2）顯微外科學(xué)方法：小鼠受精后3-4天，由子宮沖取胚泡，利用顯微操作系統(tǒng)直接從胚泡中吸出ICM細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng).（3）組織培養(yǎng)法:在小鼠受精2.5天后切除卵巢，給予外源激素，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，但延緩著床，4-6天后，從子宮中取胚泡進(jìn)行培養(yǎng)。滋養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)并在培養(yǎng)皿底壁上鋪展，而ICM細(xì)胞增殖，垂直向上生長(zhǎng)，形成卵圓柱狀結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下用玻璃針挑出這種柱狀結(jié)構(gòu)，消化傳代。第43頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四2.選擇抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系由于ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中極易分化和失去正常二倍體核型，進(jìn)

22、而失去全能性或多能性和喪失形成嵌合體動(dòng)物的能力，因此需特殊的培養(yǎng)條件阻止其分化，以確保維持其全能性或多能性。目前常用的抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系有:1、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系：先用常規(guī)的培養(yǎng)液如DMEM對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞鋪滿低壁后，用射線照射，使細(xì)胞分裂停止，形成特殊的細(xì)胞層，即飼養(yǎng)層。然后將囊胚或PGCs與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)就可抑制ICM細(xì)胞或PGCs的分化，并促進(jìn)其分裂，進(jìn)一步分離獲得ES細(xì)胞。此種方法效率高，結(jié)果穩(wěn)定，較為常用。第44頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四第45頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四2、條件培養(yǎng)體系：直接放入到特殊的培養(yǎng)液中。這

23、種培養(yǎng)液來(lái)源于某些細(xì)胞如豚鼠肝臟細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞和小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞等飼養(yǎng)一段時(shí)間后回收的液體。這些細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中不僅能分泌LIF，同時(shí)IGF-II等生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)ES細(xì)胞的生長(zhǎng)。第46頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四3、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系：將分化抑制因子LIF或白介素6（IL-6）家族按照一定濃度直接添加到囊胚或PGCs的培養(yǎng)液中，分離ES細(xì)胞。方法簡(jiǎn)單，且能避免飼養(yǎng)層細(xì)胞的干擾。目前只在小鼠ES細(xì)胞取得成功。第47頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四小鼠采用超排卵途徑收集胚胎 雌性成年小鼠注射5U孕馬血清促性腺激素（MPS），48h

24、后再注射5U人絨毛膜促性腺激素（HCG）； 與雄鼠合籠，自然交配，陽(yáng)性者為0天（即0.5dpc）； 第三天至第四天中午（即3.5 dpc4.5 dpc）分別剖取孕鼠子宮，沖出早期胚泡，進(jìn)一步分離培養(yǎng)建立ES細(xì)胞系； 剖取發(fā)育至8.5 dpc10.5 dpc時(shí)的胚胎，可建立小鼠EG細(xì)胞系。 第48頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四四、ES細(xì)胞和EG細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程 ES細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程 基本培養(yǎng)液DMEM液 15%20% FCS0.1mmol/L巰基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml鏈霉素-巰基乙醇是一種還原劑，其主要作用是降低氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷，體外培養(yǎng)必須抑制自由基

25、的氧化，所以-巰基乙醇是保護(hù)蛋白不被自由基氧化的很好的高效的物質(zhì)。第49頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四將胚泡接種于預(yù)先鋪有作為滋養(yǎng)層而無(wú)有絲分裂活性的單層MEF細(xì)胞的培養(yǎng)皿中 用免疫手術(shù)法分離胚泡的ICM細(xì)胞，或用常規(guī)培養(yǎng)法分離出ICM細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)。 培養(yǎng)23天 第50頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四免疫手術(shù)法 44.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋養(yǎng)外層胚層和未分化的ICM細(xì)胞組成，前者細(xì)胞表面一般已表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC），能識(shí)別其相應(yīng)抗體和形成免疫復(fù)合物，在補(bǔ)體存在時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生免疫溶解。具體操作如下： 第51頁(yè)，共69頁(yè)

26、，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四體外培養(yǎng)的胚泡，用酸性Tyrodes液（pH2.5）處理，去除透明帶； Hanks洗滌，加入兔抗JCR小鼠脾臟細(xì)胞抗血清（抗H2b）； 移至含新鮮豚鼠血清的培養(yǎng)液，Hanks液洗滌后，移至96孔鋪有MEF或STO飼養(yǎng)層細(xì)胞和DMEM基本培養(yǎng)液的板內(nèi)進(jìn)一步培養(yǎng)。 30min胚泡的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞呈泡狀，發(fā)生免疫溶解；而ICM細(xì)胞不具H2b抗原，細(xì)胞完整；30min第52頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四常規(guī)培養(yǎng)法 未去透明帶的胚泡培養(yǎng)34天，ICM細(xì)胞團(tuán)從貼壁胚泡內(nèi)長(zhǎng)出來(lái)； 胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37消化5min； 解離的細(xì)

27、胞團(tuán)移至滋養(yǎng)層的24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)4天，可在一些孔內(nèi)見(jiàn)到巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)； 胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)并繼續(xù)培養(yǎng)，克隆和純化ES細(xì)胞。視ES細(xì)胞巢密度轉(zhuǎn)移到較大容積的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。第53頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四五.ES細(xì)胞的保存1.常規(guī)保存：通過(guò)不斷的更換分化抑制培養(yǎng)液，以傳代培養(yǎng)方式維持ES的不分化狀態(tài)。如人的ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代2年仍維持不分化狀態(tài)。2.冷凍保存：通過(guò)超低溫冷凍保存使細(xì)胞的代謝活動(dòng)完全停止，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。第54頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四六.ES細(xì)胞的鑒定通過(guò)分離培養(yǎng)獲得的ICM或PGCs細(xì)胞在傳到

28、812代時(shí)，需要通過(guò)生化或細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)的鑒定最終確認(rèn)為ES細(xì)胞系。1.形態(tài)：呈克隆狀生長(zhǎng)，即單個(gè)ES細(xì)胞能繁殖呈形態(tài)、功能和遺傳基礎(chǔ)完全相同的一簇細(xì)胞，并凝聚成團(tuán)，外觀形似鳥(niǎo)巢。2.階段特異性胚胎抗原(SSEA)：對(duì)細(xì)胞表面的SSEA通過(guò)化學(xué)方法檢測(cè)，先將細(xì)胞用多聚甲醛固定，在用生物素標(biāo)記的二抗和辣根過(guò)氧化物的底物處理，來(lái)鑒定細(xì)胞表面的特異性糖蛋白。第55頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四3.端粒酶檢測(cè)：通常ES細(xì)胞端粒酶水平遠(yuǎn)高于其他分化的體細(xì)胞，可用正常體細(xì)胞或癌細(xì)胞做對(duì)照，用專(zhuān)用試劑盒檢測(cè)。4.Apase（堿性磷酸酶）：可通過(guò)組織化學(xué)方法鑒定，細(xì)胞經(jīng)乙醇或病痛甲醛

29、固定后，直接加入底物，即可鑒定Apase的表達(dá)水平，都應(yīng)該為陽(yáng)性。5.核型分析：傳到25代時(shí)需要進(jìn)行核型分析，分析時(shí)先在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的秋水酰胺，使細(xì)胞同步在M期，然后用低滲溶液處理，經(jīng)乙醇冰醋酸溶液固定后染色和顯微照相，最后進(jìn)行核型分析，檢測(cè)細(xì)胞是否維持在二倍體狀態(tài)。第56頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四6.發(fā)育分化潛力：（1）體外誘導(dǎo)分化：是把ES細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)分化抑制物的普通培養(yǎng)液中，如果ES細(xì)胞能自動(dòng)聚合并分化形成胚狀體，可初步確認(rèn)具有發(fā)育多能性；（2）畸胎瘤實(shí)驗(yàn)：把ES細(xì)胞注射到有免疫缺陷成年小鼠或遺傳同質(zhì)動(dòng)物的皮下或腎臟、睪丸的被膜下，如果能形成畸胎

30、瘤，可初步判定為細(xì)胞具有多能性。第57頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四（3）嵌合體實(shí)驗(yàn)：把培養(yǎng)的ES細(xì)胞與早期胚胎的卵裂球聚合，或直接把ES細(xì)胞注入囊胚腔，然后讓重組胚在體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，通過(guò)檢測(cè)后代的嵌合狀況，分析ES細(xì)胞的分化潛力。只有當(dāng)操作后的胚胎發(fā)育為嵌合體，注入的細(xì)胞能分化為內(nèi)、中和外三胚層細(xì)胞，并參與細(xì)胞生殖干細(xì)胞形成時(shí)，才能確認(rèn)為ES細(xì)胞。目前，只有小鼠、猴和人能到達(dá)以上指標(biāo)。第58頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四1 如何維持體外擴(kuò)增時(shí)不分化？2 分化細(xì)胞的增殖是一個(gè)瓶頸問(wèn)題：數(shù)量和純度3 如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化？明確干細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制4 胚胎干細(xì)胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破5 如何克服移植排斥問(wèn)題？破壞或改變細(xì)胞許多基因的可行性，核移植是否激活卵細(xì)胞的沉默基因，是否改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)？6 胚胎干細(xì)胞的安全性如何？畸胎瘤，腫瘤形成？7 倫理之爭(zhēng)七.ES細(xì)胞技術(shù)目前存在的問(wèn)題第59頁(yè)，共69頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)40分，星期四1.ES細(xì)胞系的分裂效率低主要原因是缺乏理想的分離培養(yǎng)體系，目前對(duì)于ES干細(xì)胞維持多能性的分子機(jī)理缺乏了解，不能根據(jù)細(xì)胞分化特點(diǎn)和維持不分化的營(yíng)養(yǎng)要求，建立合理的培養(yǎng)體系，