酶分析法課件

1、第二章 酶分析法第一節(jié) 酶活力測定法第二節(jié) 酶法分析酶分析法的兩種類型酶活力測定：以酶為分析對象，也就是根據(jù)需要對樣品進行酶含量或活力的測定。酶法分析：以酶作為分析工具或分析試劑，用以測定樣品中用一般化學方法難以檢測的物質，這些物質可以是酶的底物，也可以是酶的抑制劑或酶的輔助因子。酶活力測定法一、酶活力二、酶活力的測定張曉靜 2009.09一、酶活力 酶活力是指酶催化某一化學反應的能力，酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學反應的反應速率來表示，兩者呈線性關系。酶反應速率越大，酶活力越高，反之越低。 酶催化的反應速率可用單位時間內底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在實際酶活性測定中一般

2、以測定產(chǎn)物的增加量為準。 酶活力的測定就是測定酶促反應的初速率。 1.概念張曉靜 2009.09一、酶活力 酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力單位表示,即酶單位(activity unit，U)。 酶單位的定義：在一定條件下，一定時間內將一定量的底物轉化為產(chǎn)物所需的酶量。這樣酶的含量就可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。 世界各地實際應用的酶活力單位的定義各不相同。同一種酶往往有幾種不同的單位。 例如，1IUlmol/min；1Kat = 1mol/s 2.酶活力單位張曉靜 2009.09一、酶活力3.酶的比活力 酶的比活力代表酶的純度，通

3、常用下式表示： 酶比活力= 酶活力單位數(shù)(U) / 蛋白質量(mg) 有時也采用每克(g)酶制劑或每毫升(mL)酶制劑含有多少個活力單位來表示。 比活力的大小可用來比較每單位質量蛋白質的催化能力。比活力是酶學研究及生產(chǎn)中經(jīng)常使用的指標。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定1.酶活力的測定步驟要求酶活力的測定方法：快速、簡便、準確。 酶活力測定均包括兩個階段：首先要在一定的條件下，酶與其作用底物反應一段時間，然后再測定反應液中底物或產(chǎn)物變化的量。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定底物：根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。要求所使用的底物均勻一致，達到一定的純度。有些

4、底物溶液要求新鮮配制，有些則可預先配制后置冰箱保存?zhèn)溆?。反應條件：據(jù)資料或試驗結果，確定酶促反應的溫度、pH等條件。溫度可選在室溫(25)、體溫(37)、酶促反應最適溫度或其他選用的溫度，一般在恒溫裝置內進行。pH應是酶促反應的最適pH，采用一定濃度和一定pH的緩沖溶液來保持。反應條件一經(jīng)確定，在反應過程中應盡量保持恒定不變。有些酶促反應要求激活劑等其他條件，應適量添加。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定底物或產(chǎn)物的變化量：反應到一定時間，取出適量的反應液，運用各種生化檢測技術，測定產(chǎn)物增加量或底物的減少量。為了準確地反應酶促反應的結果，應盡量采用快速、簡便、準確的方法測出結果。反應時間：

5、在一定條件下，將一定量的酶液與底物溶液混合均勻，適時記下反應開始的時間。反應到一定時間及時終止反應。終止酶促反應的方法要根據(jù)酶的特性、反應底物或產(chǎn)物的性質以及檢測方法等加以選擇。常用：加熱、添加酶變性劑、加入酸液或堿液、冰浴等。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定2.酶活力的測定方法 測定反應液中物質的變化量，可采用光學檢測法、化學檢測法等生化檢測技術。 一種酶可能有多種測定方法，要根據(jù)實際情況選用。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定1.分光光度法 分光光度法主要利用底物和產(chǎn)物在紫外光或可見光部分的光吸收度的不同，選擇一適當?shù)牟ㄩL，測定反應過程中反應進行的情況。其優(yōu)點是簡便、節(jié)省時間和樣

6、品，可檢測到nmol/L水平的變化。該方法可以連續(xù)地讀出反應過程中光吸收的變化，已成為酶活力測定中一種重要的方法之一。幾乎所有的氧化還原酶都可以用此法測定。 張曉靜 2009.09二、酶活力的測定 由于分光光度法有其獨特的優(yōu)點，因此可以把一些原來沒有光吸收變化的酶反應通過與一些能引起光吸收變化的酶反應偶聯(lián)，使第一個酶反應的產(chǎn)物轉變成為第二個酶的具有光吸收變化的產(chǎn)物來進行測量。這種方法稱為酶偶聯(lián)測定法。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定3.同位素測定法 用帶有放射性同位素標記的底物經(jīng)酶作用后得到產(chǎn)物，通過適當?shù)姆蛛x，測定產(chǎn)物的脈沖數(shù)即可換算出酶的活力單位。 已知六大類酶幾乎都可以用此方法測定

7、。 通常用于底物標記的同位素有3H、14C、32P、35S和131I等。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定 優(yōu)點：反應靈敏度極高，可直接用于酶活力的測定，也可用于體內酶活性測定。特別是適用于低濃度的酶和底物的測定。 缺點：操作繁瑣，樣品需分離，反應過程無法連續(xù)跟蹤，且同位素對人體有損傷作用。輻射猝滅會引起測定誤差，如3H發(fā)射的射線很弱，甚至會被紙吸收。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定4.電化學方法 電化學方法包括：pH測定法和離子選擇電極法等。 pH測定法最常用的是玻璃電極，配合一高靈敏度的pH計，跟蹤反應過程中H+變化的情況，用pH的變化來測定酶的反應速率。也可以用恒定pH測定法，

8、在酶反應過程中，所引起的H+的變化用不斷加入堿或酸來保持其pH恒定，用加入的堿或酸的速率來表示反應速率。用此法可以測定許多酯酶的活力。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定 在使用離子選擇電極法測定某些酶的酶活力時,用氧電極可以測定一些耗氧的酶反應。如葡萄糖氧化酶的活力就可用這個方法很方便地測定。張曉靜 2009.09二、酶活力的測定5.其他方法 除上述方法外，還有一些測定酶活力的方法，例如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等，但這些方法使用范圍有限，靈敏度較差,只是應用于個別酶活力的測定。張曉靜 2009.09三、測定過程中應注意的問題1、分析產(chǎn)物比分析底物準確度高。2、反應初始階段的速度才能反

9、應酶的真正活力。3、測得的反應速度必須和酶濃度之間有線性比例關系。張曉靜 2009.09一、終點測定法指經(jīng)過一段時間(一般為幾分鐘)的反應，反應進行到完全，使全部底物(被測物)轉變成產(chǎn)物，稱終點法，更確切地說應稱平衡法，這是最理想的分析類型。整個反應達到平衡，由于正向反應的平衡常數(shù)很大，可認為所有的被測定物已轉變?yōu)楫a(chǎn)物，反應液的吸光度不再增加(或降低)，吸光度的增加(或降低)程度與被測定物的濃度成正比。 終點法對反應條件(如酶量、pH、溫度)小的改變不敏感，只要這種改變不影響在一定時間內反應達到平衡即可. 張曉靜 2009.091、終點法的條件必須有專一地作用于被測物質的酶，并能得到它的制品；

10、能夠確定使這種酶反應就近進行完全的條件；反應中底物的減少、產(chǎn)物的增加、輔酶物質的改變等可以借助某種簡便的方法進行測定。張曉靜 2009.093、終點法種類單酶反應定量法和指示酶反應偶聯(lián)的定量法張曉靜 2009.094、采用終點法應注意的問題酶底物的專一性反應的平衡性反應液中的酶量反應產(chǎn)物抑制張曉靜 2009.09二、反應速度法反應速度法又稱連續(xù)檢測法，是指在多個時間點連續(xù)監(jiān)測產(chǎn)物（或底物）在線性范圍內的生成量（或消耗量）即零級反應速率測定酶活性的方法。張曉靜 2009.091、利用作底物的測定法在一定pH及溫度下測定反應初速度。反應時除被測物（底物）外，其他影響反應速度的物質均為過剩，則反應初速度與被測物的濃度成正比關系。張曉靜 2009.092、利用輔酶或抑制劑作用測定如被測物質可作為某種酶專一的輔酶（或抑制劑），則這種物質的濃度和將其作為輔酶（或抑制劑）的酶的反應速度之間有關聯(lián)，因此通過測定該酶的反應速度就能進行這種物質的定量。張曉靜 2009.093、特殊的反應速度測定法將與待測物