基因組序列詮釋

1、關于基因組序列詮釋第1頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四問題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因、研究基因的功能呢？第2頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四1. 尋找基因1.1 根據開放讀碼框預測基因A 起始密碼子 ATG第一個ATG的確定(依據Kozak規(guī)則); Kozak規(guī)則是基于已知數據的統計結果. 所謂Kozak規(guī)則，即第一個ATG側翼序列的堿基分布所滿足的統計規(guī)律.第3頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四Kozak規(guī)則: 若將第一個ATG中的堿基A，T，G分別標為1，2，3位

2、，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1) 第4位的偏好堿基為G；(2) ATG的5端約15bp范圍的側翼序列內不含堿基T；(3) 在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4) 除-3，-6和-9位，在整個側翼序列區(qū)，C是偏好堿基。第4頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四B 信號肽分析 信號肽分析軟件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把預測過程中證實含完整mRNA 5端的序列翻譯為蛋白序列; 然后用SignalP軟件對前50個氨基酸序列(從第一個ATG對應的甲硫氨酸Met開始)進行評估，如果SignalP分析給出正面結

3、果，則測試序列有可能為信號肽; 第5頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 C 終止密碼子 終止密碼子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 終止密碼子每 64 bp出現一次； GC% 50% 終止密碼子每100200 bp 出現一次； 由于多數基因 ORF 均多于50個密碼子，因此最可能的選擇應該是 ORF 不少于100 個密碼子。第6頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四D 3端的確認 3端的確認主要根據Poly(A)尾序列,若測試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據加尾信號序列“AATAAA”和BLAST同源性比較結果共同判斷。第7頁，共44

4、頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四E 非編碼序列、內含子 高等真核生物多數外顯子長度少于100 個密碼子，有的不到50個密碼子甚至更少；第8頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四F 密碼子偏愛性 編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。 不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。第9頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 G 外顯子內含子邊界 外顯子和內含子的邊界有一些明顯的特征， 如:內含子的5端或稱供體位（donor site）常見的順

5、序為 5AGGTTAAGT-3； 3端又稱受體位（acceptor site), 多為5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；第10頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 H 上游控制序列 幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調控序列，它們可與DNA結合蛋白作用，控制基因表達。 通過同源性比較來預測mRNA的5端，最常用的與轉錄起始位點相關的數據庫是真核啟動子數據庫(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http:/www.epd.unil.ch/ )。 另外個別生物基因組的特有組

6、成也可作為判別依據，如脊椎動物基因組許多基因的上游都有CpG島。 第11頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 I 軟件預測 采用NCBI的ORF預測軟件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判斷ORF的可能范圍。第12頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 1.2 同源查詢途徑 通過已存入數據庫中的基因順序與待查的基因組序列進行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。 第13頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四同源有如下幾種情況： A DNA序列某些片段完全相同；B 開放讀碼框（O

7、RF）排列類似，如有長外顯子；C 開放讀碼框翻譯成氨基酸序列的相似性；D 模擬多肽高級結構相似第14頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四1.3 試驗分析 Northern 雜交確定DNA片段是表達序列. 注意事項： a 當某一基因的轉錄產物進行可變剪接時，由于連接的外顯子不同，會產生好幾條長度不一的雜交帶; 如果該基因是某一基因家族的成員也會出現多個信息； b 考慮組織專一性和發(fā)育階段的問題；第15頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第16頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第17頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四c 基

8、因表達產物豐度的問題 如果風度較低，用擬Northern 雜交和動物雜交（Zoo-blotting）分析。 擬Northern 雜交 根據已知的DNA順序設計引物，從mRNA群體中擴增基因產物，再以DNA為探針與之雜交。第18頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四動物園雜交 根據親緣關系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。如果某一物種的DNA 順序與來自另一親緣物種的DNA片段雜交產生陽性信號，該區(qū)段可能含有1個或多個基因，這種方法又稱為動物園雜交。第19頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第20頁，共44頁，2022年，5月2

9、0日，6點3分，星期四2 獲取基因全長cDNA序列A 構建cDNA文庫，用目的基因DNA片段篩選文庫。第21頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四cDNA文庫構建(CLONTECH)第22頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四cDNA文庫構建第23頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四B 根據已知片段設計引物，RACE 技術得到基因的全長cDNA序列。 第24頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四5RACE(CLONTECH)第25頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四3RACE(CLONTECH)第26頁，共44

10、頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第27頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第28頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四3.確定DNA序列中基因的位置A 通過對全長cDNA序列的測序、對比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B 通過物種已建立遺傳圖和物理圖來確定基因的位置；第29頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4.實驗確認基因功能4.1 基因剔除(knock-out) 最簡便的基因失活的方法. 主要原理: 在一段無關DNA 片段的兩側連接與代換基因兩側相同的序列,將這一構建導入目的細胞,由于同源片段之間的重組,可使無

11、關片段取代靶基因,整合到染色體中.為了便于篩選,用于取代的外源DNA中含有報告基因. 第30頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4.2 基因超表達 通過增加基因的拷貝數和采用強啟動子促使基因超表達,致使受體表現出生長與發(fā)育的異常,來研究基因的功能.第31頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 4.3反義RNA 反義RNA是由基因的負鏈編碼,可與正義RNA (sense RNA)或DNA 編碼順序結合,干擾mRNA 的轉錄,加工和轉運,調控基因的表達.第32頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四構建反義RNA 表達載體: 將全目的基因或部分目的基

12、因反向插入表達載體 轉化目標生物 獲得轉基因個體或品系 分析轉基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判別目的基因的功能第33頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四正義表達載體反義表達載體第34頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四反義RNA 作用機理： A 干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結合形成雙鏈RNA，隨之被細胞降解。 B 與mRNA 的引導順序結合，阻止核糖體的附著，使翻譯無法啟動。 C 反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板,轉錄終止。第35頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4.4 RNAi干涉

13、 RNAi干涉是通過雙鏈RNA的介導,特異性地降解相應序列的mRNA,從而阻斷相應基因表達的轉錄后水平的基因沉默機制.第36頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四RNAi 作用機理A dsRNA核酸內切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成2125 個核苷酸長的RNA鏈;B 這些小片段RNA(siRNA)作為另一個核糖核酸復合體RISC(RNA-induce silencing complex,RNA誘導沉默復合體)的指引物,結合到RISC上,使之識別并降解mRNA,從而導致與雙鏈RNA同源的基因沉默;第37頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第38頁，共4

14、4頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四RNAi設計方法及應用A Fraser 合成與開放讀碼框相對應的雙鏈RNA或利用細菌克隆表達這些雙鏈RNA微量注射和喂食干擾同源基因的表達B Chuang 等設計出嵌合體結構 連接強啟動子大量表達雙鏈mRNA干擾同源基因的表達第39頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四HbF基因的RNAi載體構建第40頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四RNAi技術的優(yōu)缺點RNAi最根本的特點是特異性RNAi具有特殊的穿越能力,如將雙鏈RNA注射在線蟲性腺里,它也會干擾到體細胞里的基因表達,而且干擾作用會傳給后代;RNAi對一些低水平表達的基因的RNAi現象并不明顯,而且?guī)讉€有相同或相似序列的基因, RNAi也會同時作用與它們.第41頁，共44頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4.5 酵母雙雜交（yeast two-hybridization）原理： 其原理涉及轉錄因子與啟動子之間的互作。 正常條件下： 轉錄因子 （包括兩個功能區(qū)域） 結合功