體內(nèi)藥分的設(shè)計與評價課件

1、第三章 體內(nèi)藥物分析方法的建立與確證 藥物分析教研室 設(shè)計依據(jù) 建立的一般步驟 驗(yàn)證的內(nèi)容與要求DistributionMetabolismAbsorptionExcretion第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù) 體內(nèi)藥物分析方法的選擇，一般根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、體內(nèi)藥物濃度大小、干擾成分的多少，樣品的預(yù)處理方法、試驗(yàn)條件和目的等因素綜合考慮，方可選擇出供生物樣品中藥物及其代謝物含量測定的分析方法。1. 測定藥時曲線 藥-時曲線 C-T (Concentration-Time curve) 以時間為橫坐標(biāo)，藥物的一些特征數(shù)量（如體內(nèi)藥量、血藥濃度、尿藥排泄速度、累積尿藥量等）為縱坐標(biāo)繪制的曲線（一

2、）明確分析方法設(shè)計的目的要求生物等效性(Bioequivalence)：一種藥物的不同制劑在相同的試驗(yàn)條件下，給以相同的劑量，反映其吸收速率和程度的主要動力學(xué)參數(shù)沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。（一）明確分析方法設(shè)計的目的要求 “首選色譜法，如HPLC、GC以及GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)。一般采用內(nèi)標(biāo)法定量，必要時采用生物學(xué)方法或生物化學(xué)方法。” 中國藥典2010版檢測寬線性范圍(CmaxCmax的1/20)方法不必強(qiáng)調(diào)方法的簡便、快速（一）明確分析方法設(shè)計的目的要求要求同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物檢測寬線性范圍高靈敏度(ng、pg級) 高專屬性(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離) 原形藥

3、物和活性代謝物同時存在可能對測定濃度的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響（一）明確分析方法設(shè)計的目的要求例：環(huán)孢霉素A監(jiān)測測定結(jié)果熒光偏振免疫法比高效液相色譜法約高30%，臨床調(diào)整劑量時，必須參照各自的有效血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（一）明確分析方法設(shè)計的目的要求3. 臨床藥物監(jiān)測 TDM (Therapeutic Drug Monitoring)單劑量給藥后的時-效曲線 方法盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品測定 大多采用UV、RIA或EIA等（二）調(diào)研文獻(xiàn)了解待測藥物的特性 已報道藥物的測定，應(yīng)綜覽文獻(xiàn)，掌握已解決和尚在的問題，同時獲得待測藥物的詳細(xì)理化特性及其在體內(nèi)的代謝情況。 文獻(xiàn)報道方法只可借鑒，不可生搬硬套！

4、無文獻(xiàn)報道的新藥品，根據(jù)新藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)，理化特性，在體內(nèi)存在的狀態(tài)及代謝情況，參考同類型藥物的文獻(xiàn)資料，設(shè)計全新的方法。2. 體內(nèi)存在狀態(tài)及其代謝情況（二）調(diào)研文獻(xiàn)了解待測藥物的特性與血漿蛋白結(jié)合的強(qiáng)弱及結(jié)合率的高低分離萃取方法 蛋白結(jié)合較強(qiáng)不宜直接采用溶劑萃取體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物濃度較低（尤其有代謝產(chǎn)物共存）代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時測定采用LC-MS、EIA等分析檢測技術(shù) （三）儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)室條件 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器設(shè)備和可能獲得的裝備加以考慮，然后考慮有可能在其它實(shí)驗(yàn)室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。（一）檢測條件的篩選 取一定量待測物或代謝物純品，按所

5、擬定的分析方法進(jìn)行體外測定，求得待測藥物濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系；濃度線性范圍；最佳檢測濃度；儀器檢測的靈敏度及測定的最佳條件。HPLC 調(diào)整檢測器(類型、條件) 色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒徑、柱長度) 流動相(組分及其配比)及其流速 柱溫、進(jìn)樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等 使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(LOQ) 良好的色譜參數(shù)(n、R、T) 適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間(tR)（一）檢測條件的篩選（二）分離條件的篩選1.以水代替空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品測定水標(biāo)準(zhǔn)品溶液樣品前處理考察 提取回收率、LOD、萃取溶劑、溶液pH值、揮發(fā)濃縮等條件。2. 以處理過的空白樣品進(jìn)行測定要求在待測藥物、代謝物、內(nèi)標(biāo)物

6、的“信號窗”無內(nèi)源性物質(zhì)信號。 空白不干擾樣品的測定?。ǘ┓蛛x條件的篩選3.以空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品測定考察線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、回收率、特異性等指標(biāo)。加入標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白生物基質(zhì)渦旋混勻4.體內(nèi)實(shí)際樣品的測定（二）分離條件的篩選 已確定的分析方法及其條件不能完全確認(rèn)是否適合于實(shí)際生物樣品的測定 確立分析方法后，尚需進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測試藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合(如血漿蛋白結(jié)合物)或代謝生成數(shù)個代謝產(chǎn)物及其進(jìn)一步的結(jié)合物(或綴合物)考察代謝產(chǎn)物對藥物、內(nèi)標(biāo)物的干擾情況 進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性第三節(jié) 分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容與要求 Accuracy Precision Specific

7、ity Sensitivity Reproducibility Recovery Matrix Effect Quality control Stability Calibration Curve & Range藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則 中國藥典二部化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 【H】GCL1-2化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則 【H】GCL2-1（一）特異性(Specificity) 空白血漿丹參酮A加入空白血漿健康受試者服藥2h后血漿樣品丹參酮A丹參酮A內(nèi)標(biāo)（一）特異性(Specificity) 左旋多巴內(nèi)源性物質(zhì)左旋多巴甲酯（二）標(biāo)準(zhǔn)

8、曲線和定量范圍（Calibration Curve & Range）C=0.0020.2ug/mlC=0.210.0ug/ml 必須用至少6個濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(n = / 5); 應(yīng)使用與待測樣品相同的生物介質(zhì); 定量范圍要能覆蓋全部待測濃度; 不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點(diǎn)。 （二）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（Calibration Curve & Range）（三）定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ） 定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，表示測定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度。 LLO

9、Q應(yīng)能滿足測定35個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/101/20的藥物濃度。其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%120%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)應(yīng)小于20%。至少應(yīng)由5個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果證明。（四）準(zhǔn)確度和精密度（Accuracy & Precision） 一般要求選擇高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品同時進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度通常選擇在LLOQ的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限；中間選一個濃度。在測定批內(nèi)精密度時，每一濃度至少制備并測定5個樣品。為獲得批間精密度，應(yīng)在不同天連續(xù)制備并測定，至少有連續(xù)3個分析批（不少于45個樣品）的結(jié)果合格。（四）準(zhǔn)確度和精密度（A

10、ccuracy & Precision）1.00 n=5 10.0 +血漿 n=5 50.0 n=5同一天Inter-Day1次/日;連測5天Intra-Day3*5=15分析批同一批連續(xù)三批Inter-BatchIntra-Batch（五）穩(wěn)定性（Stability）標(biāo)準(zhǔn)溶液短期室溫長期低溫(-4 ,-20 )生物樣品短期室溫長期低溫(-20 ,-70 )反復(fù)冷凍解凍（六）提取回收率（Extraction Recovery）從生物樣本基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值除以標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的響應(yīng)值即為分析物的提取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物提取出來供分析的比例?？疾旄?、中、低3個濃度的提取回

11、收率，其結(jié)果應(yīng)精密并具有可重現(xiàn)性。 考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物損失程度（六）提取回收率（Extraction Recovery）回收率 (%)=A測/A真100%A測：被測藥物標(biāo)準(zhǔn)品加入空白樣品中，按設(shè)定方法處理、進(jìn)樣測定，測得的色譜峰面積A真：純品溶劑溶解并稀釋使其濃度與第一份處理后濃度一致，進(jìn)樣測得的色譜峰面積 A測=A藥/A內(nèi)100% A真=A藥/A內(nèi)100%內(nèi)標(biāo)法0.5 ml PlasmaSample 50lIS 50l混勻堿化乙酸乙酯 5 ml渦旋3min3500 rpm 離心 8 min上清液 4 ml氮?dú)獯蹈蓺堅(jiān)颩P復(fù)溶200 l20 l 上清液 進(jìn)樣分析（六）提取回收率

12、（Extraction Recovery）0.5 ml PlasmaSample 50lIS 50l混勻1.5 ml MeOH渦旋 1min16000 rpm 離心 8min 20 l 上清液 進(jìn)樣分析（六）提取回收率（Extraction Recovery）（七）基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect） 基質(zhì)（matrix） 尚無統(tǒng)一的解釋，曾稱為“一種分析物（analyte）的環(huán)境（milieu）”，即指標(biāo)本中除分析物以外的一切組成。 以血清膽固醇（Chol）測定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化學(xué)性質(zhì)。（七）基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect）直流電壓（DC） 射頻電壓

13、RF（七）基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect）電噴霧源(ESI)（七）基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect）大氣壓化學(xué)電離源(APCI) （八）方法學(xué)質(zhì)控 每個分析批生物樣品測定時應(yīng)建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并隨行測定高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品。每個濃度至少雙樣本，并應(yīng)均勻分布在未知樣品測試順序中。 當(dāng)一個分析批中未知樣品數(shù)目較多時，應(yīng)增加各濃度質(zhì)控樣品數(shù)，使質(zhì)控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%。 質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于15%，低濃度點(diǎn)偏差一般應(yīng)小于20%。最多允許1/3的質(zhì)控樣品結(jié)果超限，但不能出現(xiàn)在同一濃度質(zhì)控樣品中。 如質(zhì)控樣品測定結(jié)果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結(jié)果作廢。 應(yīng)用

14、示例LC-MS/MS法研究氨金黃敏顆粒中對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺和馬來酸氯苯那敏 精密吸取血漿樣品0.5mL,置10 mL玻璃離心管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液100L (500gL-1) ,渦旋混勻30 s后,加乙酸乙酯5mL,渦旋混勻3 min, 1750g離心5 min,分取上清液4 mL, 40 水浴中以氮?dú)獯蹈?殘留物用200L流動相渦旋溶解, 16800 g離心5min,取上清液20L進(jìn)行LC-MS/MS分析,按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算血漿樣品中對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺及馬來酸氯苯那敏的濃度。1. 血漿樣品處理方法應(yīng)用示例2. 專屬性應(yīng)用示例3. 線性范圍及定量下限 對乙酰氨基酚血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)

15、曲線濃度(C)分別為8, 16, 32, 80, 160, 320,800, 1 600, 3 200和8 000gL - 1 ;鹽酸金剛烷胺血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度(C)分別為0. 8, 1. 6, 3. 2, 8. 0,16. 0, 32. 0, 80. 0, 160, 320和800gL - 1 ;馬來酸氯苯那敏血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度(C )分別為0. 04,0.08, 0. 16, 0. 40, 0. 80, 1. 60, 4. 00, 8. 00, 16. 0 和40. 0gL - 1 ;以對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺和馬來酸氯苯那敏與內(nèi)標(biāo)峰面積比(R )定量。應(yīng)用示例應(yīng)用示例4. 回收率取空白血漿分別加對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺和馬來酸氯苯那敏對照品溶液適量使成濃度分別為16, 32.0 和3 200 gL - 1 , 1.6,32.0和320gL - 1 , 0. 08, 1. 60和16. 0gL - 1的低、中、高不同濃度血漿樣本各5份,