固定化酶及固定化菌體課件

1、第二講 固定化酶和固定化菌體 第一節(jié) 微生物酶第二節(jié) 酶的特性第三節(jié) 固定化酶第四節(jié) 固定化菌體第二講 固定化酶和固定化菌體 第一節(jié) 微生物酶第一節(jié) 微生物酶一 生物催化劑酶二 微生物酶的優(yōu)越性三 菌體內(nèi)酶與菌體外酶本節(jié)內(nèi)容：第一節(jié) 微生物酶一 生物催化劑酶本節(jié)內(nèi)容：一 生物催化劑酶 微生物酶：微生物生活細胞產(chǎn)生的具有催化作用和專一激活能力的蛋白質(zhì)。 在常溫、常壓下對復雜的生物化學反應 有特異的催化作用。在物理化學條件下 不穩(wěn)定?？赏ㄟ^改變物理、化學條件控 制酶的反應。 在發(fā)酵過程中就是利用微生物的酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)代謝和控制生產(chǎn)。一 生物催化劑酶 微生物酶：微生物生活細胞產(chǎn)生的具有催化二 微生物酶的

2、優(yōu)越性1 酶的來源：動物、植物、微生物。 （1）微生物生長速度快，易于大量培養(yǎng)。 （2）通過菌種選育改進培養(yǎng)條件，便于人為提高產(chǎn)量。 （3）菌種不同，產(chǎn)生酶的種類有差異。 （4）利用微生物酶反應，以活菌體進行催化，簡化工藝，縮短反應周期。 （5）產(chǎn)量高、成本低、不受季節(jié)限制，便于工業(yè)化生產(chǎn)。2 微生物酶的優(yōu)越性二 微生物酶的優(yōu)越性1 酶的來源：動物、植物、微生物。 （三 菌體內(nèi)酶與菌體外酶1 菌體內(nèi)酶 產(chǎn)生的酶分布在微生物細胞內(nèi)，又叫胞內(nèi)酶。胞內(nèi)酶的使用：（1）把酶從菌體細胞內(nèi)抽提出來。繁雜、易失活（2）固定化細胞。用一定的方法將微生物菌體固定在載體上制成固定化菌體。簡單、利用率高、不易失活。

3、 如：大腸桿菌產(chǎn)生的青霉素酰胺酶的利用。三 菌體內(nèi)酶與菌體外酶1 菌體內(nèi)酶胞內(nèi)酶的使用： 2 菌體外酶產(chǎn)生的酶分泌到菌體外，又叫胞外酶。胞外酶的使用：（1）除去菌體，把含酶的培養(yǎng)濾液直接用于生物催化反應。（2）把酶抽提出來用一定的方法制成“固定化酶”。如：葡萄糖淀粉酶與羧甲基纖維素（CMC）離子結合制成的固定化酶 2 菌體外酶產(chǎn)生的酶分泌到菌體外，又叫胞外酶。胞外酶的第二節(jié) 酶的特性一 酶的催化性二 酶的專一性三 影響酶反應速度的因素第二節(jié) 酶的特性一 酶的催化性一 酶的催化性A+B C+D酶反應enzymetic resction酶底物：接收酶催化的化學反應的物質(zhì)。A、B酶的催化性：改變底物

4、原子排列并增進反應速度的功能微生物酶的催化性是在常溫、常壓下起作用的一 酶的催化性A+B C+D酶反應enzy二 酶的專一性絕對專一性：一定的酶只能作用于一定的底物。酶對底 物有很強的選擇性。能從多種復雜的底物 混合物中與特定底物反應。如：脲酶只能 作用于尿素。相對專一性：一種酶除能與特定底物作用外，也能與同底 物化學結構相類似的底物起作用。 酶對底物的選擇性較低。如：D氨基酸氧化 酶能催化多種D氨基酸脫氨。立體異構專一性：一種酶只能作用于旋光異構體的一種 或順反異構體的一種。如：L乳酸 脫氫酶只能作用于L乳酸。反丁烯 二酸酶只能作用于分丁烯二酸。二 酶的專一性絕對專一性：一定的酶只能作用于一

5、定的底物。酶對三 影響酶反應速度的因素最適反應溫度：能形成最大反應速度的溫 度.在適溫范圍內(nèi)，隨溫度 上升，反應速度上升。溫 度每增高10，速度提高 12倍受溫度、氫離子濃度、酶濃度、底物濃度等因素影響。1 溫度微生物體內(nèi)30601 B-半乳糖苷酶2 酰化氨基酸水解酶3 葡萄糖異構酶三 影響酶反應速度的因素最適反應溫度：能形成最大反應速度的溫2 氫離子濃度酶蛋白是兩性電解質(zhì)。酶活性在特定的電荷狀態(tài)下發(fā)揮。酸性系統(tǒng)，越傾向于酸，正電荷越多。堿性系統(tǒng)，越傾向于堿，負電荷越多。酸堿都會降低酶活甚至失活。最適PH值：能保持最大 酶活性的PH 值 約在5 10。中性居 多。2 氫離子濃度酶蛋白是兩性電解

6、質(zhì)。酶活性在特定的電荷狀態(tài)下發(fā)3 酶濃度對反應速度的影響 底物充足、條件適合，酶反應速度與酶濃度成正比。 4 底物濃度對反應速度的影響米門公式：V=V最大SKm+S V： 反應速度 V最大:最大反應速度 Km: 米氏常數(shù) S： 底物濃度（1） 當Km=S時，V=（2） S Km時，V= V與S成正比。一級反應（3） S Km時， V=V最大 V與S無關。 零級反應V最大2V最大SKm3 酶濃度對反應速度的影響4 底物濃度對反應速度的影響米門米門公式圖示米門公式圖示縱上所述，直接利用微生物酶（1）不穩(wěn)定。在高溫、高壓、強酸、強堿下。（2）易失活。即使在最適合的條件下反應。（3）回收困難。用適當方

7、法提取目的產(chǎn)物后，殘存酶回 收困難。（4）反應速度減慢。隨著反應時間的推移。（5）經(jīng)濟上不合算。一次性反應后不能再次使用。阻礙了微生物酶的應用和發(fā)展。研制固定化酶和固定化菌體縱上所述，直接利用微生物酶（1）不穩(wěn)定。在高溫、高壓、強第三節(jié) 固定化酶一 固定化酶的源流二 酶固定化后的性質(zhì)變化三 固定化酶的形態(tài)和作用模型四 酶的固定化方法舉例五 制備和應用固定化酶需注意的幾個方面第三節(jié) 固定化酶一 固定化酶的源流固定化酶immobilized enzyme是1971年在美國舉行的第一次世界酶會議上推薦確定的。又稱水不溶性酶、固相酶。固定化酶：水溶性酶通過物理和化學的方法，使之與不溶性載體結合形成的一

8、種不再溶解的酶。50年代開始。將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，再與羧 肽酸、淀粉酶等結合制成最早的固定 化酶1969年。 用固定化氨基?；覆鸱諨L-氨基酸 。第一個工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。固定化酶immobilized enzyme是1971年在美什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體固定化技術水不溶性酶（固定化酶）什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體固定化技術水不溶性酶固定化酶(Immobilized Enzyme）是20世紀60年代發(fā)展起來的項新技術。以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這些水溶性酶催化結束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的進一步發(fā)展。60年代后，在酶學研究領域內(nèi)涌現(xiàn)出固定化酶。它是通過

9、物理的或化學的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚讣砜`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用；過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。 從60年代起，固定化酶的研究發(fā)展很快，起初人們把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年來，不但固定化方法和載體開發(fā)有了長足發(fā)展，并且已轉向它在工業(yè)、醫(yī)藥、化學分析、親和層析、環(huán)境保護、能源開發(fā)以及理論研究等方面的應用研究。一 固定化酶的源流固定化酶(Immobilized Enzyme）是20世紀6固定化酶的優(yōu)缺點固定化酶: 固定化酶的研究已取得大量重要成果發(fā)揮著巨大作用，受到人們極大的關注。其重要原因是它和水溶性酶比較具有以下優(yōu)點：(1)極易

10、將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝.(2)可以在較長時間內(nèi)反復使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。(3)酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化和微電腦化。(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。(5)較能適應于多酶反應。(6)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。固定化酶的優(yōu)缺點固定化酶: 固定化酶的研究已取得大量重要成 固定化酶也存在一些缺點：(1)酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。(2)比較適應水溶性底物和小分子底物。(3)與完整細胞比較，不適于多酶反應，特別是需要輔因子的反應，同時對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后才

11、能固定化。 固定化酶也存在一些缺點：二 酶固定化后的性質(zhì)變化酶固定化后，原有的某些性狀會產(chǎn)生一定變化。1 對底物的特異性。尤其注意立體結構對催化底物特異性的影響。2 酶反應最適PH值的改變。酶固定化后，酶蛋白質(zhì)的電子狀態(tài)會發(fā)生改變，載體表面的電位要受影響。但有規(guī)律，可調(diào)整固定化方法，獲得最適合的反應條件。3 動力學常數(shù)的改變。米氏常數(shù)和最大反應速度會改變4 酶反應溫度的改變5 增加酶的穩(wěn)定性。對熱、PH值、有機溶媒、蛋白質(zhì)變性劑、蛋白質(zhì)分解酶的穩(wěn)定性增加。連續(xù)化反應穩(wěn)定性好。固定化酶的最大好處二 酶固定化后的性質(zhì)變化酶固定化后，原有的某些性狀會產(chǎn)生一定三 固定化酶的形態(tài)和作用模型1 制備固定化

12、酶的方法2 固定化酶的形態(tài)結構模型3 固定化酶的作用模型及其反應機理三 固定化酶的形態(tài)和作用模型1 制備固定化酶的方法1 制備固定化酶的方法化學方法、物理方法、物理與化學結合法三種。制備時應注意：（1）保護酶蛋白的立體結構不變。（2）避免不溶性載體與酶的活性中心發(fā)生作用（3）在溫和條件下進行，避免高溫、高壓、強酸堿等1 制備固定化酶的方法化學方法、物理方法、物理與化學結合法三（1）化學方法制備的固定化酶的形態(tài)結構模型1 離子結合法2 交聯(lián)法3 載體結合法4 架橋法5 網(wǎng)絡結合6 酶網(wǎng)共價鍵結合法1234562 固定化酶的形態(tài)結構模型（1）化學方法制備的固定化酶的形態(tài)結構模型1 離子結合法共價（

13、2）物理方法制備的固定化酶的形態(tài)結構模型1 物理吸附法2 包埋法3 微型膠囊法4 凝膠格子型5 空心纖維型6 纖維絲型123456（2）物理方法制備的固定化酶的形態(tài)結構模型1 物理吸附法12（3）物理化學結合法制備的固定化酶的形態(tài)結構模型1 架橋、包埋結合法；2 包埋與離子結合法；3 共價結合包埋法123（3）物理化學結合法制備的固定化酶的形態(tài)結構模型1 架橋、包3 固定化酶的作用模型及其反應機理（1）作用模型可以連續(xù)進行催化反應（適宜的底物濃度、溫度、pH值）以羧甲基纖維素固定葡萄糖淀粉酶水解淀粉生產(chǎn)葡萄糖為例說明。3 固定化酶的作用模型及其反應機理（1）作用模型以羧甲基纖維（2）反應機理載

14、體的作用： 保持酶的立體結構 保護酶的活性中心 保證酶的連續(xù)催化反應（2）反應機理載體的作用： 保持酶的立體結構四 酶的固定化方法舉例（一） 載體結合法制備固定化酶（二） 包埋法制備固定化酶（三） 交聯(lián)法制備固定化酶（四） 固定化酶的制法及其特性比較四 酶的固定化方法舉例（一） 載體結合法制備固定化酶（一）載體結合法制備固定化酶1 常用載體 粒子大小、網(wǎng)目結構表面積大小、親水性部分的量、化學組成等方面考慮。 纖維素、右旋糖酐、葡萄糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃2 常用方法 按載體結合形式分為：共價鍵結合法 離子鍵結合法 物理吸附法（一）載體結合法制備固定化酶1 常用載體2 常用方法1.2.3

15、 共價鍵結合法 共價鍵結合法是酶蛋白的側鏈基團和載休表面上的功能基團之間形成共價鍵而固定的方法。其優(yōu)點是：酶與載體結合牢固，酶不易脫落，但反應條件較激烈，酶易失活，同時，制作手續(xù)亦較繁瑣。酶分子和載體連接的功能基團 在實際中偶聯(lián)最普遍的基團是：氨基、羧基以及苯環(huán)。被偶聯(lián)的基團還應是酶活性的非必需基團，否則將導致酶失去活性。1.2.3 共價鍵結合法(2)載體的選擇 載體直接關系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對載體的一般要求是:一般親水載體在蛋白質(zhì)結合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定 性上都優(yōu)于疏水載體。載體結構疏松，表面積大，有一定的機械強度。載體必須有在溫和條件與酶共價結合的功能基團。載休沒有或很少有非專一

16、性吸附。載體來源容易方便并能反復使用。(2)載體的選擇 2 常用方法之一共價鍵結合法 酶與不溶于水的載體以共價鍵形式結合制備固定化酶的方法。即，通過化學共價鍵，把與酶蛋白活性無關的氨基酸功能基團連接在不溶于水的載體上。（1）酶與載體反應的主要功能基團游離羥基：肽鏈C末端的 羧基，天門冬酰氨酸 ，谷氨酸的羧基 游離氨基：肽鏈N末端的 氨基， 賴氨酸 氨基巰基：半胱氨酸羥基：絲氨酸，蘇氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：組氨酸2 常用方法之一共價鍵結合法 酶與不溶于水的載體以2 常用方法之一共價鍵結合法（2）所用載體重氮化法：具有氨基的不溶性載體（RNH2）。 以稀鹽酸和亞硝酸鈉作用形成重氮化合物。 多糖類衍

17、生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃烷 化 法：鹵族的乙酰衍生物（氯乙酰纖維素、溴乙酰纖 維素、碘乙酰纖維素） 含鹵族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）2 常用方法之一共價鍵結合法（2）所用載體重氮化法：具有2 常用方法之一共價鍵結合法（4）優(yōu)缺點優(yōu)點：酶與載體結合較牢固，不易脫落，有利于長 時間使用。缺點：制備條件復雜；酶蛋白活性中心易破壞2 常用方法之一共價鍵結合法（4）優(yōu)缺點優(yōu)點：酶與載體結1.2.1 吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。(1) 物理吸附法: 通過氫鍵、疏水作用和電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上從而制成固定化酶。常用的載體有： 有機載體。纖維素、骨膠原、火棉

18、膠及面筋、淀粉等。比如用纖維索作為吸附劑，用膨潤的玻璃紙或膠棉膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸脂酶、6磷酸葡萄糖脫氫酶。吸附后在載體表面形成單分子層，吸附蛋白能力約70mg/cm2。無機載休。氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。比如用多孔硅為載體吸附米曲酶和枯草桿菌的r淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45進行固定化，用高濃度的底物進行連續(xù)反應半衰期分別為14、35、60d。無機載體的吸附容量較低、而且酶容易脫落。1.2.1 吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。無(2)離子交換吸附法: 這是將酶與含有離予交換基的水不溶載體相結合而達到固定化的一種方法。酶吸附較牢，在工業(yè)上頗具廣泛的用

19、途。常用的載體有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類（ECTEDLA）纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)纖維素、DEAE葡聚糖凝膠、Amberlite IRA93、410、900等。陽離子交換劑基，如羧甲基(CM)纖維素、纖維素檸檬酸鹽、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。此外，DEAE纖維素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。(2)離子交換吸附法: 這是將酶與含有離予交換基的水不溶載 通過酶蛋白化學修飾來增加蛋白質(zhì)分子上電荷能有效的克服吸附法制備的固定化酶在使用過程的解吸。用水溶性乙烯順丁烯二酸酐共聚物共價修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋

20、白酶、可以用DEAE纖維素和DEAEScphadex載體有效的固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附與解吸還與介質(zhì)中離子強度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度及酶和載體的特性相關。pH的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對酶的吸附。在等電點兩側(1-2pH單位)吸附將明顯減少，但也有個別例外。鹽對吸附的影響較為復雜在一些特殊事例中、鹽可以促進蛋白質(zhì)的吸附。這就是所謂的鹽析吸附。對蛋白質(zhì)吸附來說，隨溫度的升高吸附下降。載體的表面積、多孔性及其頂處理都影響對酶的吸附。 通過酶蛋白化學修飾來增加蛋白質(zhì)分子上電荷能有效 吸附法制備固定化酶操作簡單，可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體，吸附過程可以同時

21、純化酶，固定化酶在使用過程失活后可重新活化，同時，載體可以回收再利用。但由于有些機理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關系不可預見性大，同時由于吸附法制備的固定化酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作為穩(wěn)定性。 吸附法制備固定化酶操作簡單，可充分選擇不同電荷、2 常用方法之二離子鍵結合法酶與具有離子交換基團的不溶性載體結合形成固定化酶（1）所用載體纖維素的衍生物，離子交換樹脂（2）固定化酶的制備機理酶蛋白的帶電基團和含有離子交換基團的固相載體之間由于靜電相吸而形成絡合物，使酶吸附到離子交換劑上。（3）優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便，處理條件溫和，酶的高級結構 和活性中心不易破壞，有利于制備高活

22、性 酶缺點：載體與酶的結合力較弱，在高離子強度下 酶易從載體上脫落2 常用方法之二離子鍵結合法酶與具有離子交換基團的不溶性2 常用方法之三物理吸附法（1）常用載體無機物有機物高分子化合物活性炭、白陶土、氧化鋁、多孔玻璃、硅膠、碳酸鈣凝膠淀粉麩質(zhì)、大孔樹脂、DEAE纖維素、DEAE葡聚糖凝膠（2）固定化酶的制備機理所用載體具有活性，可將酶吸附到載體上。（3）優(yōu)缺點 優(yōu)點：酶蛋白活性中心不易被破壞，完整保持酶的 高級結構;方法簡單，成本低。 缺點：酶吸附不牢固，易脫落； 防止吸附酶的蛋白質(zhì)與載體發(fā)生變性反應2 常用方法之三物理吸附法（1）常用載體無機物有機物活性物理吸附法固定化酶舉例載體固定化酶活

23、性炭 淀粉酶、 淀粉酶蔗糖轉化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化鋁葡萄糖氧化酶碳酸鈣凝膠亮氨酸氨肽酶纖維素胰蛋白酶、核糖核酸酶麩素淀粉液化酶硅膠磷酸化酶物理吸附法固定化酶舉例載體固定化酶活性炭 淀粉酶、 （二） 包埋法制備固定化酶 酶本身不參與反應，僅用物理方法把酶包埋在凝膠細小的格子中，或包圍在半透膜或聚合物中。包埋方法有兩種：1 格子型固定化酶2 微型膠囊法（二） 包埋法制備固定化酶 酶本身不參與反應，僅用物理1 格子型固定化酶（1）原理 以丙烯酰胺、硅膠、淀粉瓊脂等材料，在酶存在下聚合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細小多孔的網(wǎng)狀格子中。反應為厭氧反應。1

24、格子型固定化酶（1）原理酶液丙烯酰胺N，N雙丙烯酰胺氫氣催化劑：四甲基乙二胺、明礬胺引聚劑：過硫酸鉀、核黃素光照聚合反應凝膠酶塊固定化酶切割（2）方法（以丙烯酰胺為材料是最常用的方法）酶液丙烯酰胺N，N雙丙烯酰胺氫氣催化劑：四甲基乙二胺、明礬固定化酶及固定化菌體課件凝膠或膜酶聚丙烯酰胺凝膠、淀粉酶葡萄糖氧化酶乳酸脫氫酶 淀粉膽堿酯酶瓊脂青霉素酰胺酶（3）制備的固定化酶凝膠或膜酶聚丙烯酰胺凝膠、淀粉酶淀粉膽堿酯酶瓊脂青霉素2 微型膠囊法（1）原理 把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球狀含酶微型膠囊。2 微型膠囊法（1）原理（2）特點微囊直徑幾微米幾百微米。低分子底物可以自由通過并進入微囊內(nèi)。與

25、酶反應后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物質(zhì)不能通過微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質(zhì)也無法進入微囊內(nèi)（2）特點微囊直徑幾微米幾百微米。表面聚合法以親水性單體和疏水性單體在表面發(fā)生聚合反應將酶包圍起來，形成微型膠囊酶。分三步：常用形成膠囊的材料和生成的聚合物種類親水性單體疏水性單體生成的聚合物聚胺聚異氰衍生物聚胺、聚酯乙二醇、多元醇聚異氰衍生物聚胺、聚酯（3）方法 表面聚合法、液中干燥法、相分離法表面聚合法以親水性單體和疏水性單體在表面發(fā)生聚合反應將酶包圍A 乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機溶媒中充分乳化。B 表面聚合：將含有疏水性單體的有機溶

26、媒加入到上述乳化液中，發(fā)生聚合反應，生成的薄膜把酶包圍起來形成微型膠囊球。三步：C 清洗：反應完成后，用有機溶劑洗去未反應的剩余單體1A 乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機（4）微型膠囊法形成的固定化酶膠囊制法囊膜的素材應用的酶表面聚合法尼龍乳糖酶羧基脫氫酶聚合脲天門冬酰胺酶液中干燥法聚苯乙烯過氧化氫酶脂肪酶脲酶相分離法火棉膠過氧化氫酶天門冬酰胺酶硝酸纖維素天門冬酰胺酶（4）微型膠囊法形成的固定化酶膠囊制法囊膜的素材應用的酶表面缺點： 單體很活躍。在膠囊化過程中要充分注意防 治酶的失活和變性。優(yōu)點： A 制備條件溫和，制得的膠囊不易變化。 B 能很好地保存天然酶的活性和特

27、性。 C 大小可任意調(diào)節(jié)，制備時間短。（5）微型膠囊法優(yōu)缺點缺點： 單體很活躍。在膠囊化過程中要充分注意防優(yōu)點： A 制（三） 交聯(lián)法制備固定化酶概念：雙功能試劑或多功能試劑與酶蛋白質(zhì)中的氨 基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)， 凝集成固定化酶1 發(fā)生作用的氨基酸殘基： 酪氨酸的酚基 胱氨酸的SH巰基 N末端的a氨基。2 常用的雙功能或多功能試劑： 戊二醛 聚甲叉雙碘乙酰胺 雙重氮聯(lián)苯胺（三） 交聯(lián)法制備固定化酶概念：雙功能試劑或多功能試劑與酶蛋3 酶網(wǎng)載體交聯(lián)法 先將酶吸附在不溶于水的載體上，再用雙功能試劑 戊二醛與酶蛋白的氨基之間交聯(lián)起來，形成酶網(wǎng)包圍在 載體表面。 常用載體：硅膠、離子交

28、換樹脂。3 酶網(wǎng)載體交聯(lián)法（四） 固定化酶的制法及其特性比較 特性制備方法共價鍵結合法離子結合法物理吸附法包埋法制法難易易難酶活力高高高低底物特異性易變不變不變不變結合能力弱中弱弱再生不可可能可能不可交聯(lián)法難中易變強不可（四） 固定化酶的制法及其特性比較 特性制備方法共價鍵離子五 需注意的幾個方面問題（一）酶活性的測定方法（二）制備過程中保持酶活性穩(wěn)定的方法（三）固定化酶的保存方法五 需注意的幾個方面問題（一）酶活性的測定方法（一）酶活性的測定方法1 測定酶的固定化量 固定化反應完成后，以原始酶量減去洗滌液（反應液） 中殘存的酶含量。2 測定顆粒直徑 固定化酶的粒徑越小，酶活性越高。固定化酶顆

29、粒直徑 大小影響酶活性。3 測定酶反應最適pH值 酶固定化后反應的最適pH較原來的酶有所變化。4 檢查酶是否脫落 測定酶活性后，濾除固定化酶，用離心所得的溶液再經(jīng) 過適當保溫檢查是否還繼續(xù)進行反應，如果溶液中出現(xiàn)酶 反應，說明酶脫落。 （一）酶活性的測定方法1 測定酶的固定化量（二）制備過程中保持酶活性穩(wěn)定的方法1 包埋法、聚丙烯酰胺凝膠法或微型膠囊法時，固定化 反應時，預先用與酶有特異親和力的底物等，保護酶 的活性中心，而后再進行固定化反應。2 以酶的前體狀態(tài)進行固定化，然后經(jīng)過活化制備固定 化酶。3 防止酶在催化反應中活性下降下降原因 （1）酶的變性 （2）吸附了酶的抑制物質(zhì)。 （3）被微

30、生物污染 （4）酶脫落 （5）載體崩潰或變形分解 （6）操作失誤（二）制備過程中保持酶活性穩(wěn)定的方法1 包埋法、聚丙烯酰胺凝（三）固定化酶的保存方法使用時固定化酶的保存是一個很重要的環(huán)節(jié)。 1 真空冷凍干燥保存（長期保存） 2 低溫保存 3 多孔玻璃的無機質(zhì)載體比纖維素等的有機質(zhì)載體 更適于長期保存。 4 無機質(zhì)載體中，以重氮結合法制備的固定化酶具 有較好的保存性。（三）固定化酶的保存方法使用時固定化酶的保存是一個很重要的環(huán)第四節(jié) 固定化菌體固定化菌體概念：把菌體細胞中特定的酶不經(jīng)過分離提純 ，直接用適當?shù)姆椒▽⒕w加以固定 來催化各種特定的生物化學反應。優(yōu)點：不需提制酶，可保持酶的活性。反復

31、使用，成 本低與固定化酶比較制備方法：與固定化酶相同，有包埋法、載體結合法 、交聯(lián)法、熱處理法、射線處理法。 其中包埋法是最理想的方法。第四節(jié) 固定化菌體固定化菌體概念：把菌體細胞中特定的固定化細胞 固定化細胞是在固定化酶的基礎上發(fā)展起來的。它的優(yōu)點如下:(1)省去了酶的分離手續(xù)為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。(2)細胞生長快、而且多、反應快。(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。(4)保持酶在細胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子的抵抗力增加。固定化細胞 固定化細胞是在固定化酶的基礎上發(fā)展起來的。它的固

32、定化細胞同時也存在些缺點： (1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。 (2)必須防止細胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。 (3)細胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散。固定化細胞同時也存在些缺點：一 包埋法1 原理 在菌體細胞本身不發(fā)生化學反應的情況下，將其 包進半透性的多聚物膜內(nèi)。小分子的底物和產(chǎn)物均可 自由出入，而菌體細胞卻不會漏出。2 方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝膠、明膠、瓊脂以制備含天門冬氨酸的大腸桿菌細胞為例將菌體細胞預先用生理鹽水懸浮，向懸浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，然后加入催化劑過硫酸胺和加速劑四甲基乙二胺，混勻后

33、放置一定時間聚合。將得到的凝膠破碎即得到固定化細胞。收率達72.5一 包埋法1 原理2 方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝膠、二 載體結合法（吸附法）1 原理 微生物細胞表面帶有電荷，在適當?shù)臈l件下可以 與載體的離子交換基團形成絡合物或吸附在載體上。2 常用載體離子交換纖維素。陰離子樹脂、DEAE纖維素。3 優(yōu)缺點 優(yōu)點：方法簡單、載體易于再生。 缺點：結合力弱，菌體細胞易脫落。二 載體結合法（吸附法）1 原理2 常用載體離子交換纖維素。動植物細胞固定化植物細胞固定化 植物細胞比菌體細胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。80年代開始研究，目前一般采用吸附法和包埋法。動植物細胞固定化植物細胞固定化

34、 植物細胞比菌體細胞嬌吸附法 吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)。或吸附于中空纖維外壁上。如將植物細胞定置在中空纖維的外壁與容器內(nèi)壁之間，培養(yǎng)液及O2在中空維管內(nèi)流動，透過中空纖維管壁(具半透膜性)，傳遞給附著于外壁的細胞，細胞代謝產(chǎn)物亦透過外壁隨管內(nèi)培養(yǎng)液流出。利用此法固定的豌豆細胞和胡蘿卜細胞進行生產(chǎn)多酚化合物的研究，可連續(xù)使用1個多月。又如將洗凈、滅茵后的泡沫塑料放進辣椒細胞培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一 段時間，細胞吸附于塑料孔洞內(nèi)，并能生長繁殖。包埋法 包埋法是將植物細胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉菜膠等多孔凝膠中。 Brodelius等(1979)首次用海藻酸鈣包

35、埋制備了固定化長春花細胞、毛地黃細胞、海巴戟細胞。吸附法動物細胞固定化 動物細胞比菌體細胞、植物細胞更嬌嫩需要最溫和的固定化方法。目前,動物細胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。吸附法 由于大多數(shù)動物細胞屬于附著細胞，它們在培養(yǎng)過程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動物細胞。主要載體及固定方法有：(1)轉瓶法。轉瓶是由玻璃或塑料制成。其表面經(jīng)一定處理而帶有電荷，如用高錳酸鉀等氧化劑，強酸、強堿或紫外輻射等表而處理，可使動物細胞附著于表面，轉瓶以一定旋轉速度進行培養(yǎng).若在轉瓶內(nèi)增大表面積，可提高生產(chǎn)能力。(2)微載體法。微載體是指直徑為100200um，相對

36、密度接近于1.0的顆粒固定化載體。它是由表面帶有電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微載體具有較大的表面，對細胞生長和物質(zhì)傳遞特別有利，但強度不夠易破碎，使用時間較短，已用于固定多種細胞。如用于生產(chǎn)p干擾素、人纖溶酶原活化劑白細胞介素及各種疫苗的細胞固定化。動物細胞固定化(3)中空纖維法 中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。將細胞胞置于管外壁扣容器外殼之間，則細胞附著于外壁上，培養(yǎng)液從管內(nèi)流動，能透過管壁進行質(zhì)熱傳遞，中空纖維起著體內(nèi)微血管的作用，有利細胞生長及其新陳代謝。已有多種中空纖維固定化細胞用于生產(chǎn)各種單克降抗體和疫苗等。

37、包埋法 包埋法根據(jù)載體與方法不同，亦有凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種.(1)凝膠包埋法。用于動物細胞固定化的凝膠主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖蛋白等。瓊脂糖包埋法是，將1一2.5的瓊脂糖加熱溶解后冷至3738,與一定量動物細胞混合后分布于石蠟油中.使溫度湖37降至10左右，可得到直徑為0.10.3mm的微球狀固定化細胞，用于單克隆抗體、白細胞介素等的生產(chǎn)。(3)中空纖維法 中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚海藻酸鈣凝膠包埋法是，將動物細胞與一定濃度的海藻酸凝膠溶液混合均勻后，用注射器將混合液滴到一定CaCl2溶液中即成。 血纖蛋白包埋法是將動物細胞與血纖蛋白混合后加入凝血酶而固定化。

38、 (2)半透膜包埋法。利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋形成微囊形固定化動物細胞。例如：先用海藻酸鈣包埋動物細胞制成膠粒后，再在外面包一層聚Lys膜，然后放入檸檬酸鈉溶液中去除海藻酸鈣，便可獲得由多聚Lys包埋的動物細胞。海藻酸鈣凝膠包埋法是，將動物細胞與一定濃度的海藻酸凝膠溶液混3.3原生質(zhì)體固定化 原生質(zhì)體固定化，首先要制備較穩(wěn)定的原生質(zhì)體，然后用凝膠進行包埋。（1）瓊脂多孔醋酸纖維固定法 用生理鹽水配制3一4的瓊脂，加熱，溶解，滅菌后冷至50左右，勺等體積一定濃度的原生質(zhì)體混合，將混合液滴加于多孔醋酸纖維上，置冰箱冷卻凝固。（2）海藻酸鈣凝膠固定法 以3一6海藻酸鈣溶液與等體積

39、定濃度的原生質(zhì)體混合，混合液滴入CaCl2溶液中，并浸泡12h。即成。（3）角叉萊膠固定法 配制1一8角叉菜膠加熱溶解，滅菌后，冷卻至50左右，與等體積原生質(zhì)體混合，混合液滴入一定濃度的預冷KCl中，即得球狀固定化原生質(zhì)體。（4）光交聯(lián)樹脂固定法 配制30一60濃度的光交聯(lián)樹脂預聚體加熱溶解后，在50左右加人1光敏劉與等體積的原生質(zhì)體混合后，攤成薄層經(jīng)紫外光照射，聚合后形成小塊，制成片狀的固定化原生質(zhì)體。 固定化原生質(zhì)體用于生產(chǎn)各種氨基酸、酶和生物堿等物質(zhì)以及甾體轉化等。3.3原生質(zhì)體固定化包埋法制備固定化菌體應用舉例包埋材料菌種酶系用途 瓊脂大腸桿菌大腸桿菌谷氨酸脫羧酶青霉素酰胺酶制造-酪蛋

40、白 生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸(6-APA)明膠戊二醛短乳桿菌鏈霉菌葡萄糖異構酶從葡萄糖生產(chǎn)高果糖漿聚丙烯酰胺大腸桿菌天門冬氨酸酶醋酸纖維素大腸桿菌青霉素酰胺酶（裂解）青霉素酰胺酶（合成）生產(chǎn)6APA生產(chǎn)半合成青霉素包埋法制備固定化菌體應用舉例包埋材料菌種酶系用途 瓊脂大腸桿載體結合法制備固定化菌體舉例載體菌體酶用途離子交換纖維素絲狀菌孢子轉化酶蔗糖的轉化陰離子樹脂放線菌葡萄糖異構酶制造果糖DEAE-纖維素巨大芽孢桿菌青霉素酰胺酶制造6APA載體結合法制備固定化菌體舉例載體菌體酶用途離子交換纖維素絲狀Thank you for your attention !Thank you for your a

41、ttention !Antigenic determinant是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱表位(epitope).Antigenic determinant是指抗原分子中決定細胞克?。河梢粋€細胞增殖而成的細胞集團細胞克?。河梢粋€細胞增殖而成的細胞集團Polyclonal antibody,PcAb：針對多種抗原決定簇的混合抗體Monoclonal antibody,McAb:由單個B細胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體Polyclonal antibody,PcAb：針對多種抗固定化酶及固定化菌體課件雜交瘤技術的理論基礎淋巴細胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學說，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細胞融合技術產(chǎn)生的雜交瘤細胞可以保持雙方親代細胞的特性利用代謝缺陷補救機理篩選雜交瘤細胞，并克隆化，制備McAb雜交瘤技術的理論基礎淋巴細胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學說，即一種克當兩個細胞緊密接觸時，細胞膜可能融合在一起。融合細胞含有兩個不同的細胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞，稱為雜交細胞（hybrid cell）。當兩個細胞緊密接觸時，細胞膜可能融合在一起。融合細胞含有兩個融合的結果及命運雜交瘤細胞未融合的脾細胞未融合的骨髓瘤細胞脾-脾雜交細胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細胞融合的結果及命運雜交瘤細胞未融合的脾細胞未融合的骨髓瘤細胞脾雜交