分子生物學(xué)分子雜交課件

1、第八章 聚合酶鏈反應(yīng) 1985年P(guān)E-cetus公司的人類遺傳研究室Mullis等人發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)。此技術(shù)能夠特異地?cái)U(kuò)增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)、法醫(yī)、考古等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展給予巨大的推動(dòng)。第一節(jié) PCR原理與特點(diǎn)第二節(jié) PCR類型第三節(jié) PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一、PCR的基本原理 在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增(圖8-1

2、)。 DNA模板變性 雙鏈DNA是通過94左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA。 模板與引物退火 將合成的兩個(gè)寡核苷酸引物分別與待擴(kuò)增DNA兩端的序列互補(bǔ)。通過控制退火條件，引物就能準(zhǔn)確地與擴(kuò)增區(qū)域的兩端配對(duì)。 引物延伸 在4種dNTP底物及Mg2+存在條件下，DNA聚合酶在最適作用溫度可將單核苷酸從引物3端摻入，沿模板延伸合成新股DNA，每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一循環(huán)的模板。 以上所述的變性、退火、延伸“三步曲”被確定為PCR的一輪循環(huán)，整個(gè)PCR過程一般需進(jìn)行三十輪的循環(huán)。 按2n的指數(shù)方式遞增， PCR擴(kuò)增量應(yīng)達(dá)到230個(gè)拷貝， “平臺(tái)效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早主要取決于起始模板的拷貝數(shù)、所用的D

3、NA聚合酶的性能及底物dNTP的濃度等多種因素。三、常規(guī)的PCR操作 反應(yīng)體系 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體積為50100l，其中含有：1PCR反應(yīng)緩沖液、四種dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、二種上、下游引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶。 反應(yīng)步驟四、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 模板核酸 PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的擴(kuò)增需首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行正常PCR循環(huán)。 引物 引物是指與待擴(kuò)增靶DNA兩端序列互補(bǔ)的寡核苷酸，兩段引物分別與相應(yīng)的一條DNA鏈3端及5端互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)一般遵循下列原則：(1)引物的序列應(yīng)選定基因組DNA的高度保守區(qū)，以減少引物與基因組

4、的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性。(2)引物的長(zhǎng)度以1540bp為宜。 (3)引物的堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在40%75%之間。(4) 引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是引物的末端應(yīng)無(wú)回文結(jié)構(gòu)。 耐熱DNA聚合酶 Taq DNA酶有良好的熱穩(wěn)定性，Taq DNA聚合酶在7075時(shí)具有最高的生物學(xué)活性。 脫氧核苷三磷酸 脫氧核苷三磷酸(dNTP)是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的總稱，是靶DNA序列擴(kuò)增的原料。dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度、MgCl2濃度、引物濃度等反應(yīng)條件。 緩沖液 目前最為常用的緩沖液體系為1050mmol/L Tris

5、-HCl (pH 8.38.8,20)。 Mg2+ Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+濃度過高則影響PCR反應(yīng)的特異性。 添加劑 PCR反應(yīng)中加入一定濃度的添加劑如DMSO (二甲基亞砜)等可提高PCR擴(kuò)增效率及特異性 PCR循環(huán)數(shù) 30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)，循環(huán)次數(shù)太少，產(chǎn)物的量不多；循環(huán)次數(shù)過多，則非特異性產(chǎn)物增加。 PCR易發(fā)生的問題及解決方法沒有得到所希望的PCR產(chǎn)物(假陰性)所有樣品均為陽(yáng)性(假陽(yáng)性)PCR產(chǎn)物呈片狀出 現(xiàn)非特異擴(kuò)增 第二節(jié) PCR類型一、不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR) 不對(duì)稱PCR的目的是擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。PC

6、R反應(yīng)中采用二種不同濃度的引物，PCR結(jié)果產(chǎn)生大量單鏈DNA。因PCR反應(yīng)中使用的二種引物濃度不同一步法，因此稱不對(duì)稱PCR，此法產(chǎn)生的單鏈DNA可用作雜交探針或DNA測(cè)序的模板。 進(jìn)行不對(duì)稱PCR有二種方法：(1) 一步法;(2) 兩步法，第一次PCR用等濃度的引物，以期獲得較多的目的DNA片段，取第一次擴(kuò)增產(chǎn)物(含雙鏈PCR片段)用單引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)生單鏈DNA。四、反向PCR (inverse PCR, IPCR)IPCR是擴(kuò)增未知序列的一種簡(jiǎn)捷方法。其基礎(chǔ)是：用限制性內(nèi)切酶消化DNA，然后環(huán)化切割的產(chǎn)物，再用切割后已知序列上兩端相反方向的引物序列進(jìn)行PCR (圖8-3)，也可

7、將環(huán)化DNA線性化后再進(jìn)行PCR。五、隨機(jī)引物PCR (arbitrary primer PCR, AP-PCR) RAPD建立在PCR基礎(chǔ)之上，它是利用一系列不同的隨機(jī)排列的寡核苷酸鏈(通常為十聚體)為引物，對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色來檢測(cè)擴(kuò)增DNA片段多態(tài)性?？捎糜谶M(jìn)行基因組指紋圖譜的構(gòu)建，并利用指紋圖譜進(jìn)行品種鑒定和對(duì)物種進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化的研究。 七、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR (single strand construction polymor-phism PCR, SSCP-PCR) 其原理是單鏈DNA分子因單一核苷酸

8、不同，其二級(jí)結(jié)構(gòu)有所差異，PCR產(chǎn)物常表現(xiàn)在非變性凝膠電泳中電泳遷移率不同。通過比較DNA的電泳類型，即可測(cè)出突變。其優(yōu)點(diǎn)是所需樣品DNA量極少，靈敏度高，可檢測(cè)出點(diǎn)突變，以及插入、缺失突變，能一次篩選多個(gè)樣品。八、俘獲PCR 一種生物素標(biāo)記的同已知序列互補(bǔ)的引物首先通過線性擴(kuò)增延伸。而后，生物素標(biāo)記的延伸產(chǎn)物，可被已包被鏈霉抗生素蛋白的固體支持物選擇性地俘獲。經(jīng)幾次洗滌，可去除所有未生物素化的DNA分子，經(jīng)過這一步純化，再進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增可大大降低非特異性擴(kuò)增背景。九、多重PCR (multiplex PCR) 多重PCR是在同一反應(yīng)中采用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)不同的DNA片段；如果被測(cè)基因某一區(qū)

9、段缺失，則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常(圖8-5)。多重PCR具有靈敏、快速特點(diǎn)，特別適用檢測(cè)單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結(jié)果與Southern雜交結(jié)果同樣可靠，且多重PCR尚可檢測(cè)小片段缺失。十、著色互補(bǔ)PCR (color complementation PCR) 該法的原理是用不同的熒光染料標(biāo)記不同引物的5端，如JoE、TAMRA及CouM等染料分別呈紅、綠、藍(lán)熒光。進(jìn)行復(fù)合PCR，合成的目的DNA片段分別帶有引物5端染料的顏色以此來判定擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果，若某一DNA區(qū)帶缺失，則無(wú)對(duì)應(yīng)染料標(biāo)記的產(chǎn)物，據(jù)此可判定基因異?；虬l(fā)現(xiàn)感染的病毒等。

10、十一、巢居PCR (nested PCR, N-PCR) N-PCR是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)引物對(duì)應(yīng)的序列在模板的外側(cè)，稱外引物(outer-primer)，另一對(duì)引物互補(bǔ)序列在同一模板的外引物的內(nèi)側(cè)，稱內(nèi)引物(inter-primer)，即外引物擴(kuò)增產(chǎn)物較長(zhǎng)，含有內(nèi)引物擴(kuò)增的靶序列，這樣經(jīng)過二次PCR放大可將單拷貝的目的DNA片段檢出。十二、半巢居PCR (heminested PCR, Hn PCR) Hn PCR是巢居PCR與不對(duì)稱PCR的結(jié)合，Hn PCR是先用等量的外引物擴(kuò)增，再用一個(gè)內(nèi)引物擴(kuò)增，產(chǎn)生大量單鏈內(nèi)引物的產(chǎn)物，Hn PCR比巢居PCR節(jié)省一個(gè)引物，又比不對(duì)稱PCR的特異性及敏

11、感性好。十三、二溫式PCR 標(biāo)準(zhǔn)PCR的一輪循環(huán)是由變性、退火、延伸三步組成的，在不影響PCR反應(yīng)特異性和敏感性前提下，可將退火、延伸溫度合并為一個(gè)溫度，采用二溫式PCR，即94變性，6568退火延伸，這樣既保證引物與模板結(jié)合特異性，又可使引物順利延伸，與標(biāo)準(zhǔn)PCR相比，二溫式PCR操作更簡(jiǎn)便、快速、特別適于臨床檢驗(yàn)。十四、增敏PCR (booster PCR, BPCR) 其基本方法是將標(biāo)準(zhǔn)PCR 30輪循環(huán)分兩次進(jìn)行，第一次引物濃度僅為數(shù)十pmol/L，延長(zhǎng)退火時(shí)間，進(jìn)行20輪循環(huán)后，靶序列濃度大大提高，再將引物濃度增至0.1mol/L，同時(shí)縮短退火時(shí)間，再進(jìn)行20輪循環(huán)。用BPCR檢測(cè)E

12、 coli BMI 195耐紅霉素基因(ere A)，可檢出糞便標(biāo)本中110個(gè)菌。十五、重組PCR 重組體的構(gòu)建（圖8-6所示） 它的原理在于巧妙地設(shè)計(jì)和利用寡核苷酸引物，共進(jìn)行二級(jí)PCR反應(yīng)。在初級(jí)的兩個(gè)PCR反應(yīng)中，每對(duì)引物中的一個(gè)引物3端與待重組基因互補(bǔ)，5端與另一個(gè)待重組基因互補(bǔ)，即在引物的5端加入一段序列作為接頭。分別進(jìn)行PCR，所得二種PCR產(chǎn)物有部分重疊序列，混合二種初級(jí)PCR產(chǎn)物進(jìn)行次級(jí)PCR，經(jīng)過變性和復(fù)性，二種PCR產(chǎn)物通過互補(bǔ)序列發(fā)生粘連，出現(xiàn)二種異雙倍體產(chǎn)物。其中一種產(chǎn)物的3末端單鏈可用Taq DNA聚合酶延伸，產(chǎn)生包含兩個(gè)重疊產(chǎn)物全長(zhǎng)的片段，作為PCR反應(yīng)的模板。由此

13、進(jìn)行PCR擴(kuò)增可產(chǎn)生一個(gè)包含兩種基因的重組基因片段，該片段保持了密碼子框架的正確性。 十六、表達(dá)PCR (expression PCR) 表達(dá)PCR則是一種更加簡(jiǎn)便的體外轉(zhuǎn)錄翻譯的方法。表達(dá)PCR是重組PCR的一種，將啟動(dòng)子序列(5TAA TAC GAC TCA CTA TA 3)和目的基因重組，產(chǎn)生重組DNA，PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子序列的目的DNA片段，可直接進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生功能性的蛋白質(zhì)。十七、競(jìng)爭(zhēng)PCR(competitive PCR) 該法的總策略是采用相同的引物，同時(shí)擴(kuò)增靶DNA和已知濃度的競(jìng)爭(zhēng)模板，競(jìng)爭(zhēng)模板與靶DNA大致相同，但其內(nèi)切酶位點(diǎn)或部分序列不同，用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物

14、或用不同的探針進(jìn)行雜交即可區(qū)分競(jìng)爭(zhēng)模板與靶DNA的PCR產(chǎn)物，因競(jìng)爭(zhēng)模板的起始濃度是已知的，通過測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)模板與靶DNA二者PCR產(chǎn)物便可對(duì)靶DNA進(jìn)行定量。十八、原位PCR (In-situ PCR) 在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特異探針進(jìn)行原位雜交即可檢出含該特異序列的細(xì)胞。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法稱原位PCR。 第三節(jié) PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一、PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是檢測(cè)人類白細(xì)胞抗原-DQ位點(diǎn)的分型，另外，Y染色體特異DNA (DYZ1、DYZ3) SRY基因的PCR分析使性別鑒定成為常規(guī)。 在Y染色體上只

15、要缺失SRY，個(gè)體就發(fā)育成為女性。 用針對(duì)SRY基因和X、Y同源序列的兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有男性出現(xiàn)299bp的擴(kuò)增片段。用這種方法鑒別胎兒、運(yùn)動(dòng)員、犯罪人員等的性別，準(zhǔn)確率極高。三、致病病毒的檢測(cè) 人類免疫缺陷病毒 人類免疫缺陷病毒HIV-1是一種RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)引物，先用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板產(chǎn)生cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該法比分子雜交、血清學(xué)等診斷方法敏感性高，且操作簡(jiǎn)便，是診斷HIV的最佳方法。 PCR可用來追蹤HIV的自然感染史。可在其他血清學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志出現(xiàn)前檢測(cè)病毒序列，從而判定無(wú)癥狀而且血清陰性患者潛在的HIV的傳播性。 肝炎病毒1.乙型肝炎病毒(

16、hepatitis B virus, HBV) 直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中HBV DNA序列的存在，對(duì)確定患者血液標(biāo)本的感染性。2.丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)與戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV) HCV是單股正鏈RNA病毒，可采用逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合巢式PCR法對(duì)急性丙型肝炎作出快速診斷。 單純皰疹病毒 PCR可檢測(cè)出1 pg的HSV-DNA，在HSV感染診斷的應(yīng)用研究上發(fā)展很快，分型檢測(cè)HSV已成為發(fā)展趨勢(shì)。 人乳頭瘤病毒 為了進(jìn)行HPV流行病學(xué)研究或?qū)m頸癌高危人群篩選，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道用共用引物(general primer)一次可擴(kuò)增多型別HPV。若將共用引物PCR與型特異性多重PCR結(jié)合起來，就可以確定型別，快速篩檢相關(guān)腫瘤的高危人群。這將大大節(jié)約時(shí)間、經(jīng)費(fèi)，對(duì)探討HPV致癌機(jī)制及宮頸癌分子流行病學(xué)研究有理論和實(shí)際意義。四、腫瘤的診斷和研究 腫瘤的檢測(cè) 人類一些血液系統(tǒng)的惡性腫瘤與特定的染色體易位或基因重排有關(guān)，這種易位、重排擾亂了基因的正常調(diào)控，可導(dǎo)致原癌基因從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)。應(yīng)用PCR技術(shù)能發(fā)現(xiàn)微量存在有染色體易位的癌細(xì)胞，如PCR能發(fā)現(xiàn)白血病或淋巴瘤治療緩解后104105正常細(xì)胞中15個(gè)腫瘤殘留細(xì)胞。PCR為腫瘤的診