新一代測(cè)序技術(shù)的引入-ThermoFisherScientific課件

1、新一代測(cè)序技術(shù)在疑難案件中的應(yīng)用新一代測(cè)序技術(shù)在疑難案件中的應(yīng)用CE法庭DNA檢測(cè)技術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)三十年的法庭科學(xué)DNA技術(shù)發(fā)展過程中,CE技術(shù)屢立奇功,目前大多數(shù)案件能夠用CE+STR的方法解決數(shù)據(jù)可靠、工作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)DNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性人類重復(fù)序列DNA探針復(fù)合擴(kuò)增STR位點(diǎn)的DNA分型新一代技術(shù)的融入？CE法庭DNA檢測(cè)技術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)三十年的法庭科學(xué)DNA技術(shù)發(fā)展DNA檢驗(yàn)技術(shù)1985年才開始運(yùn)用于法庭科學(xué)檢驗(yàn)鑒定中，但由于可以到達(dá)個(gè)人認(rèn)定的作用發(fā)展迅速。20多年的發(fā)展，DNA從DNA指紋圖發(fā)展到STR檢驗(yàn)。DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)靈敏度得到了提高，可以檢測(cè)到ng(106g )級(jí)ST

2、Rs英國第一起移民糾紛案的DNA指紋圖高降解識(shí)別率高識(shí)別率能自動(dòng)分型結(jié)果數(shù)字化快速分型檢驗(yàn)時(shí)間縮短基于PCR方法微量DNA等位基因不連鎖費(fèi)用較貴信息量大DNA檢驗(yàn)技術(shù)1985年才開始運(yùn)用于法庭科學(xué)檢驗(yàn)鑒定中，但主要有以下幾方面的作用1、同一認(rèn)定：除同卵雙生的雙胞胎、骨髓移植的患者外，兩個(gè)人基因分型相同的概率只有100億分之一（1010）。主要有以下幾方面的作用1、同一認(rèn)定：除同卵雙生的雙胞胎、骨髓2、親緣認(rèn)定（遺傳關(guān)系）2、親緣認(rèn)定（遺傳關(guān)系）母系遺傳 （mtDNA）母系遺傳 （mtDNA）父系遺傳（Y染色體）?uncle3rd cousinThomas Jefferson IIField J

3、effersonPeter JeffersonPresident Thomas JeffersonEston HemingsThomas WoodsonDifferent Y HaplotypeSame Y HaplotypeJefferson Y HaplotypeJefferson Y Haplotype?父系遺傳（Y染色體）?uncle3rd cousinThom3、現(xiàn)場(chǎng)重建3、現(xiàn)場(chǎng)重建1of6 樣本高度降解，僅能得到部分、甚至得不到STR圖譜 復(fù)雜混合樣本解釋 復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定 未知來源的組織、體液溯源 表型推斷 始祖推斷 當(dāng)前法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室的挑戰(zhàn)更高的要求，更多的挑戰(zhàn)1of6 樣本

4、高度降解，僅能得到部分、甚至得不到STR圖譜當(dāng)疑難案件的檢測(cè)有待新技術(shù)的融入10混合檢測(cè)降解/痕量檢材數(shù)據(jù)庫無記錄疑難復(fù)雜家系但CE本身技術(shù)上的局限性,無法在一些疑難案件上取得實(shí)質(zhì)性的突破,領(lǐng)域中需要有新技術(shù)的融入疑難案件的檢測(cè)有待新技術(shù)的融入10混合檢測(cè)降解/痕量檢材數(shù)據(jù)新一代測(cè)序技術(shù)的引入新一代測(cè)序技術(shù)(Next Generation Sequencing)也稱高通量測(cè)序 同時(shí)能測(cè)幾千到幾百萬的DNA片段，后續(xù)通過組裝和對(duì)比完成。 下一代測(cè)序平臺(tái)能測(cè)到200-400bp，甚至更長。 高通量；全基因組；高覆蓋度新一代測(cè)序技術(shù)的引入新一代測(cè)序技術(shù)(Next Generat廣東省廳NGS平臺(tái)一覽

5、1of6廣東省廳NGS平臺(tái)一覽1of6124 SNP位點(diǎn)（含90個(gè)常染色體位點(diǎn)和34個(gè)Y染色體位點(diǎn)）Pi ranges from 1x10-31 6x10-35擴(kuò)增長度短(平均132, 141nts,) 適合降解 DNA推薦1ng 起始DNA對(duì)于 43 Ken Kidd SNPs， 有99.99% 的一致性微量、高度降解檢材,復(fù)雜親緣關(guān)系輔助鑒定HID-Ion AmpliSeq 身份鑒定試劑盒124 SNP位點(diǎn)（含90個(gè)常染色體位點(diǎn)和34個(gè)Y染色體位點(diǎn)Coverage% PositiveGenotypeMajor Allele每個(gè)SNP位點(diǎn)信息樣本間的比對(duì)Y 單倍型預(yù)測(cè)HID-Ion Ampl

6、iSeq 身份鑒定試劑盒Coverage% PositiveGenotypeMajo 因祖墳遷移事件，80余歲的事主無法確定祖墳內(nèi)究竟是否是自己的祖墳。故需要做相關(guān)親緣鑒定。但由于嚴(yán)重降解, 毛細(xì)管電泳技術(shù)無法得到有效的分型。故通過二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè) NGS案例應(yīng)用(1):高度降解檢材檢材狀況：案件背景檢材狀況 因祖墳遷移事件，80余歲的事主無法確定祖墳 NGS案例應(yīng)用(1):高度降解檢材牙齒檢材:參照血卡:牙齒檢材已經(jīng)嚴(yán)重降解,無法得到有效分型,并進(jìn)行下一步的鑒定 NGS案例應(yīng)用(1):高度降解檢材牙齒檢材:參照血卡:牙齒 NGS案例應(yīng)用(1):高度降解檢材NGS結(jié)果展示: NGS

7、案例應(yīng)用(1):高度降解檢材NGS結(jié)果展示:利用ID panel進(jìn)行個(gè)體識(shí)別身份驗(yàn)證： 牙齒檢材 對(duì)照檢材符合孟德爾規(guī)律位點(diǎn)不符合孟德爾規(guī)律的位點(diǎn)常染色體位點(diǎn)79906811Y染色體位點(diǎn) 24 3423 1全部位點(diǎn)103 1249112NGS測(cè)序結(jié)果顯示，90個(gè)常染色SNP位點(diǎn)中，雙方均出齊的位點(diǎn)為79個(gè)，其中有11個(gè)位點(diǎn)不符合孟德爾遺傳規(guī)律。且Y位點(diǎn)有一個(gè)位點(diǎn)不一致，故排除墳?zāi)怪械墓嗜耸鞘轮鞯纳?NGS案例應(yīng)用(1):高度降解檢材利用ID panel進(jìn)行個(gè)體識(shí)別身份驗(yàn)證： 牙齒檢材 最終信息常染色體位點(diǎn)Y染色體位點(diǎn)共出位點(diǎn)無名尸結(jié)果741993 因無相關(guān)數(shù)據(jù)庫和對(duì)照樣本，所以無法進(jìn)行相關(guān)比

8、對(duì)。但是可建議放入宗卷，以便將來數(shù)據(jù)庫或其他參照樣本可以進(jìn)行對(duì)比利用ID panel進(jìn)行個(gè)體識(shí)別身份驗(yàn)證：CE結(jié)果顯示無名尸骨高度降解： NGS案例應(yīng)用(2):高度降解無名尸 最終信息常染色體位點(diǎn)Y染色體位點(diǎn)共出位點(diǎn)無名尸結(jié)果7鑒定莫XX和莫XX的丈夫是否為孩子A和孩子B的親身父母。莫XX為骨髓移植患者，且移植已多年，效果不錯(cuò)，考慮其血液可能表現(xiàn)為供體基因分型，遂要求采其口腔拭子、血拭子、指甲和頭發(fā)；要求提供骨髓移植供體的血拭子；其丈夫、孩子A、孩子B的口腔拭子共8份檢材，使用Identity SNP Panel 在PGM平臺(tái)上檢測(cè)。同時(shí)使用Global Filer試劑盒結(jié)果作為參照. NGS

9、案例應(yīng)用(3):移植患者親子鑒定鑒定莫XX和莫XX的丈夫是否為孩子A和孩子B的親身父母。 N莫XX、莫XX丈夫、兩個(gè)孩子的SNP分型符合孟德爾遺傳；該結(jié)果與使用Global Filer做出來的結(jié)果完全一致。莫XX血液與骨髓供體的SNP分型完全一致；與自身頭發(fā)分型不一致。莫XX頭發(fā)、指甲的SNP分型完全一致；Samples莫-口腔莫丈夫-口腔孩子B-口腔莫-血骨髓供體-血孩子A-口腔莫-頭發(fā)莫-指甲莫-口腔67798888819191莫丈夫-口腔67686565686262孩子B-口腔79687373868282莫-血886573100767979骨髓供體-血886573100767979孩子A

10、-口腔81688676768282莫-頭發(fā)916282797982100莫-指甲916282797982100 NGS案例應(yīng)用(3):移植患者親子鑒定莫XX、莫XX丈夫、兩個(gè)孩子的SNP分型符合孟德爾遺傳；該結(jié)Bone, teeth, and hair are the typical biological sources left from missing persons or remains失蹤人員/無名尸體常見生物性檢材：骨頭、牙齒、頭發(fā)Ion AmpliSeq technology can streamline the mtGenome sequencing workflowIon Am

11、pliSeq 技術(shù)科簡(jiǎn)化線粒體基因組測(cè)序流程線粒體全基因組/高變區(qū)測(cè)序試劑盒Average amplicon length is 163ntAverage amplicon overlap of 11ntIon AmpliSeq mtGenome Panels線粒體全基因組測(cè)序Bone, teeth, and hair are the 打拐工作開展過程中懷疑安徽省的沈某（現(xiàn)年43歲）是山西省的連某（現(xiàn)年59歲，疑似姐姐） 家中走失親人。由于年事已高，雙親皆故。所以需要進(jìn)行疑似親姐妹全同胞/半同胞鑒定。解決思路： 若直接采取傳統(tǒng)CE對(duì)全同胞進(jìn)行檢測(cè)需要檢測(cè)進(jìn)行至少超過39個(gè)STR位點(diǎn)，在根據(jù)IB

12、S評(píng)分來進(jìn)行斷定，若IBS評(píng)分為42分以上，準(zhǔn)確率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基礎(chǔ)，結(jié)合打拐案情，可直接對(duì)兩者的線粒體進(jìn)行測(cè)序，判斷是否來自同一母系。 NGS案例應(yīng)用(4):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路 NGS案例應(yīng)用(4):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路線粒體二代測(cè)序結(jié)果展示軟件分析的參考序列參考序列序列在該位點(diǎn)上的分型測(cè)試樣本在該位點(diǎn)上的分型線粒體二代測(cè)序結(jié)果展示軟件分析的參考序列參考序列序列在該位點(diǎn)連某沈某一致位點(diǎn)不一致位點(diǎn)線粒體全基因組25271326高變區(qū)24424高變區(qū)14618通過線粒體全基因組測(cè)序，排除連某與沈某是來自于同一母系連某沈某一致位點(diǎn)不一致位點(diǎn)線

13、粒體全基因組25271326高變： 若直接采取傳統(tǒng)CE對(duì)全同胞進(jìn)行檢測(cè)需要檢測(cè)進(jìn)行至少超過39個(gè)STR位點(diǎn)，在根據(jù)IBS評(píng)分來進(jìn)行斷定，若IBS評(píng)分為42分以上，準(zhǔn)確率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基礎(chǔ)，結(jié)合打拐案情，可直接對(duì)兩者的線粒體進(jìn)行測(cè)序，判斷是否來自同一母系。 NGS案例應(yīng)用(5):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路： NGS案例應(yīng)用(5):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路疑似妹妹疑似姐姐一致位點(diǎn)不一致位點(diǎn)線粒體全基因組4848471高變區(qū)25550高變區(qū)14440通過線粒體全基因組測(cè)序，不排除兩份受檢者來自于同一母系PS: 不一致位點(diǎn)為疑似姐姐在非高變區(qū)存在一個(gè)點(diǎn)異質(zhì)性

14、變異疑似妹妹疑似姐姐一致位點(diǎn)不一致位點(diǎn)線粒體全基因組484847沒有嫌疑人，DNA數(shù)據(jù)庫未比中始祖推斷或者表型推斷，如眼睛顏色、頭發(fā)顏色和皮膚顏色，可以給案件偵查提供更多線索HID-Ion AmpliSeq 祖先推斷試劑盒擴(kuò)增子長度短 (平均長度122;130 nt) 推薦1ng 起始DNA55 Ken Kidd SNPs，99.77% 的一致性165 常染色體SNP沒有嫌疑人，DNA數(shù)據(jù)庫未比中HID-Ion AmpliSe版式設(shè)計(jì)版式設(shè)計(jì)165 常染色體SNP適合案件檢材或者降解DNA擴(kuò)增片段短(平均122;130 nt) 推薦1ng 起始DNA對(duì)于55個(gè) Ken Kidd SNP，有99

15、.77% 一致性HID-Ion AmpliSeq始祖推斷試劑盒版式設(shè)計(jì)版式設(shè)計(jì)HID-Ion AmpliSeq始祖推斷試對(duì)實(shí)驗(yàn)室積累種族樣本,包括5個(gè)封閉的滿族家系和5個(gè)封閉的新疆家系進(jìn)行始祖定位始祖認(rèn)定二代測(cè)序結(jié)果展示對(duì)實(shí)驗(yàn)室積累種族樣本,包括5個(gè)封閉的滿族家系和5個(gè)封閉的新疆5組封閉滿族種族定位：盡管都能定位到Han-HapMap,但是無法在地域上進(jìn)一步細(xì)分 NGS案例應(yīng)用(6):滿族及維族始祖認(rèn)定5組封閉滿族種族定位：盡管都能定位到Han-HapMap,但五組新疆建庫樣本種族定位：基本能夠定位在和維族遺傳很近的民族(Hazara),在地域定位比較一致準(zhǔn)確 NGS案例應(yīng)用(6):滿族及維族

16、始祖認(rèn)定五組新疆建庫樣本種族定位：基本能夠定位在和維族遺傳很近的民族NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢(shì)更加適合降解檢材：容納更多的mini-STR獲得更多的信息：同一分型不同序列NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢(shì)更加適合降解檢材：容納更多的NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢(shì)可以給予更多信息9947A ，NGS- D8S1179基因分形結(jié)果基因分型的結(jié)果類似于CE的展示結(jié)果同一基因型不同分型的結(jié)果NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢(shì)可以給予更多信息9947ACE-STR復(fù)雜家系NGS-STR驗(yàn)證(1)將十余對(duì)CE-STR復(fù)雜家系用STR-panel進(jìn)行驗(yàn)證：一致案例父親分型：11,13母親分型：8，98，12子代分型：CE-STR復(fù)雜家系NGS-STR驗(yàn)證(1)將十余對(duì)CE-CE-STR復(fù)雜家系NGS-STR驗(yàn)證(2)4, 1413, 13 4, 13父親NGS分型：母親NGS分型：子代NGS分型：家系背景 通過CE結(jié)果顯示父親在D19S433的分型為14,14.目前在D19S433的分型為13,13.小孩的分型為13,13.初步判定為時(shí)一個(gè)一步突變的家系.故用新一代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行STR分型驗(yàn)證.CE結(jié)果與二代測(cè)序不符,且二代測(cè)序結(jié)果符合孟德爾遺傳定律CE-STR復(fù)雜家系NGS-STR驗(yàn)證(2)4, 1413CE-STR復(fù)雜家系