新一代測序技術的引入-ThermoFisherScientific課件

1、新一代測序技術在疑難案件中的應用新一代測序技術在疑難案件中的應用CE法庭DNA檢測技術金標準三十年的法庭科學DNA技術發(fā)展過程中,CE技術屢立奇功,目前大多數(shù)案件能夠用CE+STR的方法解決數(shù)據(jù)可靠、工作簡單、快速、經(jīng)濟、數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)DNA擴增片段長度多態(tài)性人類重復序列DNA探針復合擴增STR位點的DNA分型新一代技術的融入？CE法庭DNA檢測技術金標準三十年的法庭科學DNA技術發(fā)展DNA檢驗技術1985年才開始運用于法庭科學檢驗鑒定中，但由于可以到達個人認定的作用發(fā)展迅速。20多年的發(fā)展，DNA從DNA指紋圖發(fā)展到STR檢驗。DNA實驗室檢驗靈敏度得到了提高，可以檢測到ng(106g )級ST

2、Rs英國第一起移民糾紛案的DNA指紋圖高降解識別率高識別率能自動分型結果數(shù)字化快速分型檢驗時間縮短基于PCR方法微量DNA等位基因不連鎖費用較貴信息量大DNA檢驗技術1985年才開始運用于法庭科學檢驗鑒定中，但主要有以下幾方面的作用1、同一認定：除同卵雙生的雙胞胎、骨髓移植的患者外，兩個人基因分型相同的概率只有100億分之一（1010）。主要有以下幾方面的作用1、同一認定：除同卵雙生的雙胞胎、骨髓2、親緣認定（遺傳關系）2、親緣認定（遺傳關系）母系遺傳 （mtDNA）母系遺傳 （mtDNA）父系遺傳（Y染色體）?uncle3rd cousinThomas Jefferson IIField J

3、effersonPeter JeffersonPresident Thomas JeffersonEston HemingsThomas WoodsonDifferent Y HaplotypeSame Y HaplotypeJefferson Y HaplotypeJefferson Y Haplotype?父系遺傳（Y染色體）?uncle3rd cousinThom3、現(xiàn)場重建3、現(xiàn)場重建1of6 樣本高度降解，僅能得到部分、甚至得不到STR圖譜 復雜混合樣本解釋 復雜親緣關系鑒定 未知來源的組織、體液溯源 表型推斷 始祖推斷 當前法醫(yī)DNA實驗室的挑戰(zhàn)更高的要求，更多的挑戰(zhàn)1of6 樣本

4、高度降解，僅能得到部分、甚至得不到STR圖譜當疑難案件的檢測有待新技術的融入10混合檢測降解/痕量檢材數(shù)據(jù)庫無記錄疑難復雜家系但CE本身技術上的局限性,無法在一些疑難案件上取得實質性的突破,領域中需要有新技術的融入疑難案件的檢測有待新技術的融入10混合檢測降解/痕量檢材數(shù)據(jù)新一代測序技術的引入新一代測序技術(Next Generation Sequencing)也稱高通量測序 同時能測幾千到幾百萬的DNA片段，后續(xù)通過組裝和對比完成。 下一代測序平臺能測到200-400bp，甚至更長。 高通量；全基因組；高覆蓋度新一代測序技術的引入新一代測序技術(Next Generat廣東省廳NGS平臺一覽

5、1of6廣東省廳NGS平臺一覽1of6124 SNP位點（含90個常染色體位點和34個Y染色體位點）Pi ranges from 1x10-31 6x10-35擴增長度短(平均132, 141nts,) 適合降解 DNA推薦1ng 起始DNA對于 43 Ken Kidd SNPs， 有99.99% 的一致性微量、高度降解檢材,復雜親緣關系輔助鑒定HID-Ion AmpliSeq 身份鑒定試劑盒124 SNP位點（含90個常染色體位點和34個Y染色體位點Coverage% PositiveGenotypeMajor Allele每個SNP位點信息樣本間的比對Y 單倍型預測HID-Ion Ampl

6、iSeq 身份鑒定試劑盒Coverage% PositiveGenotypeMajo 因祖墳遷移事件，80余歲的事主無法確定祖墳內(nèi)究竟是否是自己的祖墳。故需要做相關親緣鑒定。但由于嚴重降解, 毛細管電泳技術無法得到有效的分型。故通過二代測序技術進行進一步的檢測 NGS案例應用(1):高度降解檢材檢材狀況：案件背景檢材狀況 因祖墳遷移事件，80余歲的事主無法確定祖墳 NGS案例應用(1):高度降解檢材牙齒檢材:參照血卡:牙齒檢材已經(jīng)嚴重降解,無法得到有效分型,并進行下一步的鑒定 NGS案例應用(1):高度降解檢材牙齒檢材:參照血卡:牙齒 NGS案例應用(1):高度降解檢材NGS結果展示: NGS

7、案例應用(1):高度降解檢材NGS結果展示:利用ID panel進行個體識別身份驗證： 牙齒檢材 對照檢材符合孟德爾規(guī)律位點不符合孟德爾規(guī)律的位點常染色體位點79906811Y染色體位點 24 3423 1全部位點103 1249112NGS測序結果顯示，90個常染色SNP位點中，雙方均出齊的位點為79個，其中有11個位點不符合孟德爾遺傳規(guī)律。且Y位點有一個位點不一致，故排除墳墓中的故人是事主的生父 NGS案例應用(1):高度降解檢材利用ID panel進行個體識別身份驗證： 牙齒檢材 最終信息常染色體位點Y染色體位點共出位點無名尸結果741993 因無相關數(shù)據(jù)庫和對照樣本，所以無法進行相關比

8、對。但是可建議放入宗卷，以便將來數(shù)據(jù)庫或其他參照樣本可以進行對比利用ID panel進行個體識別身份驗證：CE結果顯示無名尸骨高度降解： NGS案例應用(2):高度降解無名尸 最終信息常染色體位點Y染色體位點共出位點無名尸結果7鑒定莫XX和莫XX的丈夫是否為孩子A和孩子B的親身父母。莫XX為骨髓移植患者，且移植已多年，效果不錯，考慮其血液可能表現(xiàn)為供體基因分型，遂要求采其口腔拭子、血拭子、指甲和頭發(fā)；要求提供骨髓移植供體的血拭子；其丈夫、孩子A、孩子B的口腔拭子共8份檢材，使用Identity SNP Panel 在PGM平臺上檢測。同時使用Global Filer試劑盒結果作為參照. NGS

9、案例應用(3):移植患者親子鑒定鑒定莫XX和莫XX的丈夫是否為孩子A和孩子B的親身父母。 N莫XX、莫XX丈夫、兩個孩子的SNP分型符合孟德爾遺傳；該結果與使用Global Filer做出來的結果完全一致。莫XX血液與骨髓供體的SNP分型完全一致；與自身頭發(fā)分型不一致。莫XX頭發(fā)、指甲的SNP分型完全一致；Samples莫-口腔莫丈夫-口腔孩子B-口腔莫-血骨髓供體-血孩子A-口腔莫-頭發(fā)莫-指甲莫-口腔67798888819191莫丈夫-口腔67686565686262孩子B-口腔79687373868282莫-血886573100767979骨髓供體-血886573100767979孩子A

10、-口腔81688676768282莫-頭發(fā)916282797982100莫-指甲916282797982100 NGS案例應用(3):移植患者親子鑒定莫XX、莫XX丈夫、兩個孩子的SNP分型符合孟德爾遺傳；該結Bone, teeth, and hair are the typical biological sources left from missing persons or remains失蹤人員/無名尸體常見生物性檢材：骨頭、牙齒、頭發(fā)Ion AmpliSeq technology can streamline the mtGenome sequencing workflowIon Am

11、pliSeq 技術科簡化線粒體基因組測序流程線粒體全基因組/高變區(qū)測序試劑盒Average amplicon length is 163ntAverage amplicon overlap of 11ntIon AmpliSeq mtGenome Panels線粒體全基因組測序Bone, teeth, and hair are the 打拐工作開展過程中懷疑安徽省的沈某（現(xiàn)年43歲）是山西省的連某（現(xiàn)年59歲，疑似姐姐） 家中走失親人。由于年事已高，雙親皆故。所以需要進行疑似親姐妹全同胞/半同胞鑒定。解決思路： 若直接采取傳統(tǒng)CE對全同胞進行檢測需要檢測進行至少超過39個STR位點，在根據(jù)IB

12、S評分來進行斷定，若IBS評分為42分以上，準確率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基礎，結合打拐案情，可直接對兩者的線粒體進行測序，判斷是否來自同一母系。 NGS案例應用(4):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路 NGS案例應用(4):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路線粒體二代測序結果展示軟件分析的參考序列參考序列序列在該位點上的分型測試樣本在該位點上的分型線粒體二代測序結果展示軟件分析的參考序列參考序列序列在該位點連某沈某一致位點不一致位點線粒體全基因組25271326高變區(qū)24424高變區(qū)14618通過線粒體全基因組測序，排除連某與沈某是來自于同一母系連某沈某一致位點不一致位點線

13、粒體全基因組25271326高變： 若直接采取傳統(tǒng)CE對全同胞進行檢測需要檢測進行至少超過39個STR位點，在根據(jù)IBS評分來進行斷定，若IBS評分為42分以上，準確率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基礎，結合打拐案情，可直接對兩者的線粒體進行測序，判斷是否來自同一母系。 NGS案例應用(5):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路： NGS案例應用(5):疑似親姐妹打拐鑒定案件背景常規(guī)思路疑似妹妹疑似姐姐一致位點不一致位點線粒體全基因組4848471高變區(qū)25550高變區(qū)14440通過線粒體全基因組測序，不排除兩份受檢者來自于同一母系PS: 不一致位點為疑似姐姐在非高變區(qū)存在一個點異質性

14、變異疑似妹妹疑似姐姐一致位點不一致位點線粒體全基因組484847沒有嫌疑人，DNA數(shù)據(jù)庫未比中始祖推斷或者表型推斷，如眼睛顏色、頭發(fā)顏色和皮膚顏色，可以給案件偵查提供更多線索HID-Ion AmpliSeq 祖先推斷試劑盒擴增子長度短 (平均長度122;130 nt) 推薦1ng 起始DNA55 Ken Kidd SNPs，99.77% 的一致性165 常染色體SNP沒有嫌疑人，DNA數(shù)據(jù)庫未比中HID-Ion AmpliSe版式設計版式設計165 常染色體SNP適合案件檢材或者降解DNA擴增片段短(平均122;130 nt) 推薦1ng 起始DNA對于55個 Ken Kidd SNP，有99

15、.77% 一致性HID-Ion AmpliSeq始祖推斷試劑盒版式設計版式設計HID-Ion AmpliSeq始祖推斷試對實驗室積累種族樣本,包括5個封閉的滿族家系和5個封閉的新疆家系進行始祖定位始祖認定二代測序結果展示對實驗室積累種族樣本,包括5個封閉的滿族家系和5個封閉的新疆5組封閉滿族種族定位：盡管都能定位到Han-HapMap,但是無法在地域上進一步細分 NGS案例應用(6):滿族及維族始祖認定5組封閉滿族種族定位：盡管都能定位到Han-HapMap,但五組新疆建庫樣本種族定位：基本能夠定位在和維族遺傳很近的民族(Hazara),在地域定位比較一致準確 NGS案例應用(6):滿族及維族

16、始祖認定五組新疆建庫樣本種族定位：基本能夠定位在和維族遺傳很近的民族NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢更加適合降解檢材：容納更多的mini-STR獲得更多的信息：同一分型不同序列NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢更加適合降解檢材：容納更多的NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢可以給予更多信息9947A ，NGS- D8S1179基因分形結果基因分型的結果類似于CE的展示結果同一基因型不同分型的結果NGS-STR用于CE輔助的優(yōu)勢可以給予更多信息9947ACE-STR復雜家系NGS-STR驗證(1)將十余對CE-STR復雜家系用STR-panel進行驗證：一致案例父親分型：11,13母親分型：8，98，12子代分型：CE-STR復雜家系NGS-STR驗證(1)將十余對CE-CE-STR復雜家系NGS-STR驗證(2)4, 1413, 13 4, 13父親NGS分型：母親NGS分型：子代NGS分型：家系背景 通過CE結果顯示父親在D19S433的分型為14,14.目前在D19S433的分型為13,13.小孩的分型為13,13.初步判定為時一個一步突變的家系.故用新一代測序平臺進行STR分型驗證.CE結果與二代測序不符,且二代測序結果符合孟德爾遺傳定律CE-STR復雜家系NGS-STR驗證(2)4, 1413CE-STR復雜家系