激光掃描共聚焦顯微課件

1、 采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，采用共軛聚焦原理和裝置，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化，并利用計算機對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套集觀察、分析和輸出為一體系統(tǒng)。它把光學(xué)成像的分辨率提高了30%40%，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代的研究工具。LSCM 的發(fā)展1957年 提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，并獲 得了美國的專利。1967年 成功的應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學(xué)橫面。1970年 牛津和阿姆斯特丹同時向科學(xué)界推薦了一種新型 的掃描共聚焦顯微鏡。198

2、4年 Bio-Rad公司推出了世界第一臺共聚焦顯微鏡品。1987年 White和Amos在英國自然雜志發(fā)表了“共聚焦 顯微鏡時代的到來”一文，標(biāo)志著LSCM已成為進(jìn)行 科學(xué)研究的重要工具。隨后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相繼開發(fā)出不同型號的共聚焦顯微鏡。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，產(chǎn)品的性能也不斷改進(jìn)和更新，應(yīng)用的范圍也越來越廣泛。Hippocampus neurons expressing GFPLSCM與普通熒光顯微鏡的圖像質(zhì)量比較熒光顯微鏡LSCMLSCM的重要組件 主要系統(tǒng)包括激光光源、自動顯微鏡、掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）、數(shù)字信號處理器

3、、計算機以及圖象輸出設(shè)備（顯示器、彩色打印機）等。激光器顯微鏡：物鏡 載物臺計算機系統(tǒng)：圖像分析與控制系統(tǒng)激光掃描共聚焦顯微鏡 vs 熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡激光作為光源的優(yōu)點單色性強 譜線寬度可小于10-8 nm方向性強 發(fā)射角僅為毫弧度數(shù)量級高亮度相干性好基于上述主要特點，激光作為掃描共聚焦顯微鏡的光源是最理想的波長功率 （mW）激光器類型325351457-514543.5632.8700-1100115210-30300251.253.520001氦鎘(He-Cd)激光器帶紫外的水冷氬離子激光小型氬離子激光綠氦氖(He-Ne)激光紅氦氖(He-Ne)激光藍(lán)寶石激光氦氖(

4、He-Ne)激光激光掃描共聚焦顯微鏡中常見的激光器激光器顯微鏡Leica DM IRBE 倒置熒光顯微鏡物鏡LSCM物鏡的重要參數(shù) NA 數(shù)值孔徑又叫做鏡口率，簡寫為N.A。是物鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷物鏡性能高低的重要標(biāo)志。 N.A=n*sin a/2 n：物體與物鏡間媒質(zhì)的折射率 a2：物鏡孔徑角的一半 溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的為1.3，空氣為1。香柏油與玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。 N.A. 越大：放大倍數(shù)越大，分辨率越高， N.A. 越大：視場寬度與工作距離越小MagnificationNumerical ApertureWorkin

5、g Distance (mm)Achromat Correction4x0.1030.0010 x0.256.1020 x0.402.1040 x0.650.6560 x0.800.30100 x (oil)1.250.18 4x 20 x 10 x 40 x 60 x 100 x 載物臺計算機系統(tǒng)圖像分析與控制系統(tǒng)分析軟件控制軟件+激光共聚焦顯微鏡原理圖1. 共聚焦顯微鏡簡化原理圖 用于激發(fā)熒光的激光束(Laser)透過入射小孔(light source pinhole)被二向色鏡(Dichroic mirror)反射，通過顯微物鏡(Objective lens)匯聚后入射于待觀察的標(biāo)本(s

6、pecimen)內(nèi)部焦點(focal point)處。激光照射所產(chǎn)生的熒光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長，直接通過二向色鏡并透過出射小孔(Detection pinhole)到達(dá)光電探測器(Detector)（通常是光電倍增管（PMT）或是雪崩光電二極管（APD），變成電信號后送入計算機。而由于二向色鏡的分光作用，殘余的激光則被二向色鏡反射，不會被探測到。共軛圖2. 探測針孔的作用示意圖（解釋了出射小孔所起到的作用） 只有焦平面上的點所發(fā)出的光才能透過出射小孔；焦平面以外的點所發(fā)出的光線在出射小孔平

7、面是離焦的，絕大部分無法通過中心的小孔。因此，焦平面上的觀察目標(biāo)點呈現(xiàn)亮色，而非觀察點則作為背景呈現(xiàn)黑色，反差增加，圖像清晰。在成像過程中，出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(focal point)是一一對應(yīng)的關(guān)系（共軛conjugate）,因而被稱為共聚焦（con-focal）顯微技術(shù)。LSCM掃描圖像方式單一光學(xué)切片掃描 (single optical section, x-y) 時程活細(xì)胞掃描 (time lapse live cell imaging, x-y-t)三維掃描及重構(gòu) (3-D reconstruction, x-y-z)四維掃描 (4-D imaging, x-y-z-

8、t)ZXYXY平面單一光學(xué)切片掃描 (single optical section, x-y)Optical sections collected simultaneously at three different excitation wavelengths (488, 568, and 647 nanometers). The specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk. XYXY平面時程活細(xì)胞掃描 (time lapse live cell imaging, x-y-t)XYXY平面timeTime-lapse im

9、aging of a living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in Figure 2. The series of images shows the change in distribution of the fluorescent probe over time. 0 s10 s20 s30 s三維掃描及重構(gòu) (3-D reconstruction, x-y-z)Peripheral nervous system of a fruit fly embryo ZXYXY平面三維掃描及重構(gòu) (3-D rec

10、onstruction, x-y-z)一種高分辨率的顯微成像技術(shù)1 用激光做光源，激光單色性好，光源波長相同，從根本上消除了色差。2 采用共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了一個帶有小孔的擋板，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差，并進(jìn)一步消除了色差。顯微圖象的清晰度和細(xì)節(jié)分辨能力。 3 采用點掃描技術(shù)將樣品分成無數(shù)個點，用十分細(xì)小的激光束逐點逐行掃描成像，再通過電腦組合成一個整體。傳統(tǒng)的光鏡在場光源下一次成像，標(biāo)本上每一點都會受到相鄰點的衍射光和散射光的干擾。這兩種圖像的清晰度和精密度是無法相比的。4 用計算機采集和處理光信號，并利用光電倍增管放大信號，它代替了人眼和照相機進(jìn)行觀察，攝像，得到的

11、圖像是數(shù)字化的，可以在電腦中進(jìn)行處理，進(jìn)一步提高圖像的清晰度。5觀察活細(xì)胞、活組織：在不損傷細(xì)胞的前提下,對活組織、活細(xì)胞進(jìn)行觀察和測量，這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程(如脫水、脫蠟、染色等);而且觀察過的樣品還可以繼續(xù)用于其他的研究。這種功能對于細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因研究尤為重要。這可以說是最大的優(yōu)勢。6 生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針,對于要檢測的成分不僅可以定位到細(xì)胞水平,還可以定位到亞細(xì)胞水平和分子水平。7 動態(tài)觀察在同一樣品平面上隨時間進(jìn)行連續(xù)掃描,就可分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)、內(nèi)含、和標(biāo)記等動力學(xué)變化。目前在這方面做得最多的是使用觀察心肌或平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣、鈉、鉀離子濃度或的動態(tài)變化。

12、8 定量測量：首先應(yīng)用專一的熒光探針對樣品進(jìn)行染色,樣品的熒光強度和所測成分的含量呈正比,如果其余條件固定,通過對比各組樣品之間的熒光強度值,可得出特定成分的含量比。 應(yīng)用范圍細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動 性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化生物化學(xué)：酶、核酸、FISH（熒光原位雜交）、受體分析藥理學(xué)：藥物對細(xì)胞的作用及其動力學(xué)生理學(xué)：膜受體、離子通道、細(xì)胞內(nèi)離子含量、分布動態(tài)神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運輸和傳遞、遞質(zhì)受體、離子內(nèi)外流、神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分布微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)病理學(xué)及臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病診斷、HIV

13、等遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷LSCM在生物學(xué)上的應(yīng)用熒光組織化學(xué)動態(tài)熒光測量 (細(xì)胞內(nèi)鈣測量、細(xì)胞內(nèi)pH測量、細(xì)胞膜流動性測量、膜電位測定)細(xì)胞間隙連接的細(xì)胞間通訊熒光探針的選擇合適的熒光探針是有效地進(jìn)行實驗并獲取理想實驗結(jié)果的保障。(1)現(xiàn)有儀器所采用的激光器(2)熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性(3)熒光的定性或定量 定性:單波長激發(fā)探針 定量:雙波長激發(fā)比率探針(4)熒光探針的特異性和毒性。(5)熒光探針適用的pH * 不同的熒光探針在不同標(biāo)本的效果常有差異，故除綜合考慮以上因素以外，有條件者應(yīng)進(jìn)行染料的篩選，以找出最適的熒光探針

14、。* 許多熒光探針是疏水性的，很難或不能進(jìn)入細(xì)胞，需使熒光探針與AM（乙酰羥甲基酯）結(jié)合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解，去掉AM后的熒光探針不僅可與細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜，從而能有效的發(fā)揮作用。常見應(yīng)用及其熒光探針 1細(xì)胞內(nèi)游離鈣 共聚焦激光掃描顯微鏡常用的有Fluo-3、 Fluo-4、 Rhod-1、 Rhod-2、 Indo-1、Fura-2等，前四者為單波長熒光探針，利用其單波長激發(fā)特點可直接測量細(xì)胞內(nèi)Ca2+動態(tài)變化，為鈣定性探針；后兩者為雙波長激發(fā)探針，利用其雙波長激發(fā)特點和比率技術(shù)，能定量細(xì)胞內(nèi)鈣，

15、為鈣定量探針。 2 DNA和RNA核酸的熒光探針 用于共聚焦激光掃描顯微鏡的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO)、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。兩種染料既可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA，如為獲得單獨的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶處理細(xì)胞。PI不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，故不能標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA。 3 膜電位 共聚焦激光掃描顯微鏡則可利用熒光探針在細(xì)胞膜內(nèi)外分布的差異測出膜電位，不但可以觀察細(xì)胞膜電位的變化結(jié)果，更重要的是可以用于連續(xù)監(jiān)測膜電位的迅速變化。 DiBAC4(3)：帶負(fù)電荷慢反應(yīng)染料。本身無熒光，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合

16、后才發(fā)出熒光，測量時要求細(xì)胞浸在熒光染料中。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)熒光強度增加即膜電位；反之，即膜電位降低。 Rhodamine 123：主要用于線粒體膜電位測量。是一種親脂性陽離子熒光探針，當(dāng)線粒體膜內(nèi)側(cè)負(fù)電荷增多時，熒光強度增加，與DiBAC4(3)的表示形式相反。 4 細(xì)胞內(nèi)活性氧基 ： 活性氧(active oxygen species)可影響細(xì)胞代謝，與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等發(fā)生反應(yīng)，有些反應(yīng)是有害的，因此測量活性氧在毒理學(xué)研究中有一定的意義。常用熒光探針有Dichlorodihydrofluorescein diacetate(2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不發(fā)熒光的H

17、2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被存在的過氧化物、過氧化氫等氧化分解為二氯熒光黃（dichlorofluorescein，DCF)而產(chǎn)生熒光。 5 細(xì)胞間通訊： 熒光光漂白恢復(fù)(fluorescence recovery after photobleading，F(xiàn)RAP)技術(shù)可用于檢測細(xì)胞縫隙連接通訊。該方法的原理是一個細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力。而臨近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴散到已被漂白的細(xì)胞中，熒光可以逐漸恢復(fù)。由于光漂白過程是不可逆的，因此可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過程的變化量來判斷細(xì)胞縫隙連接的通訊功能。 6 細(xì)胞膜流動性 ： 熒光光漂白恢復(fù)(F

18、RAP)技術(shù)。利用NBD-C6-HPC標(biāo)記膜磷脂，然后用高強度的激光束照射活細(xì)胞膜表面的某一區(qū)域(12m)，使該區(qū)域的熒光淬滅或漂白，再用較弱的激光束照射該區(qū)域?？蓹z測到細(xì)胞膜上其他地方未被漂白的熒光探針流動到漂白區(qū)域時的熒光重新分布情況。熒光恢復(fù)的速率和程度可提供有關(guān)的信息。 7 細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞器探針） 共聚焦激光掃描顯微鏡可獲得較高分辨率的細(xì)胞內(nèi)線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器圖像，同時還可動態(tài)觀察活細(xì)胞狀態(tài)下細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化情況，此外還可通過光學(xué)切片即斷層掃描技術(shù)進(jìn)行三維重建，顯示細(xì)胞器的空間關(guān)系及其變化。適用于線粒體的熒光探針較多，如Mitotracker、DA SP

19、MI、DA SPEI、JC-1、羅丹明 123等。高爾基復(fù)合體常用的熒光探針有NBD ?；拾贝迹╟eramide）、BODIPY 酰基鞘氨醇。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶體的熒光探針有DAMP、neutral red。 8. pH值 正常細(xì)胞胞漿內(nèi)的pH一般在6.87.4的范圍，而某些細(xì)胞器如溶酶體的pH則在4.56.0之間。根據(jù)檢測對象pH的不同將熒光探針分為用于偏中性和酸性兩類。常用于偏中性pH即細(xì)胞胞漿pH檢測的熒光探針有SNARF類(SNARF-1、SNARF-calcein)、SNAFL類(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，這些探針均為疏水性

20、探針，須使用其AM形式。FITC-dextran則適用于pH范圍46之間，如溶酶體pH的檢測，該探針也不能透過質(zhì)膜，但可通過細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入溶酶體，因此應(yīng)選擇分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。 9 標(biāo)記抗體、配體等常用的熒光探針 共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可用免疫熒光分析固定的細(xì)胞或組織切片，還可用于分析活細(xì)胞，得到特異性抗體或其他熒光免疫探針識別靶分子的表達(dá)、定位、分布變化等信息。 10 檢測酶活性的熒光探針 共聚焦激光掃描顯微鏡在檢測活細(xì)胞酶活性動態(tài)變化方面有著無可比擬的優(yōu)勢。通過對細(xì)胞施予不同的處理因素可檢測細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的酶被激活或滅活的動態(tài)變化過程。有的酶熒光探針是自身就可發(fā)出熒光、有

21、的是與酶結(jié)合后發(fā)出熒光、有的則是被酶分解后發(fā)出熒光。實例1 細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測量鈣的熒光探針Fura-2 最常用的比例測量法熒光探針，激發(fā)峰為340/380nm，發(fā)射波長在505-520nm之間。Fura-2可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后在330-350nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生較強的熒光，而在380nm激發(fā)光下則會導(dǎo)致熒光減弱。這樣就可以使用340nm和380nm這兩個熒光的比值來檢測細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素。 實例1 測定爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)鈣變化手術(shù)分離卵母細(xì)胞膠原酶消化中和消化液，停止消化18C靜止細(xì)胞4小時，以備后

22、用Xenopus oocytes卵母細(xì)胞微注射Calcium green用細(xì)胞內(nèi)液稀釋Calcium green導(dǎo)入微注射器以20nL/oocyte注射卵母細(xì)胞18C避光放置40分鐘共聚焦顯微鏡觀察IP3引起的卵母細(xì)胞內(nèi)鈣升高實例2 Fluo-4測定HEK293細(xì)胞內(nèi)鈣變化前一天HEK293消化傳代Fluo-4 AM孵育液的配制Fluo-4AM 5 uM+20%F127避光孵育HEK細(xì)胞15分鐘DMEM+10%FBS沖洗細(xì)胞2次在細(xì)胞外液中避光靜置30分鐘移入共聚焦顯微鏡載物臺，進(jìn)行觀察實例3 細(xì)胞膜磷脂PIP2的動態(tài)測定HEK293 cells expressing PLC-PH-GFPPL

23、C-PH-GFP + H1 receptor LipofactAMINE2000 混合20分鐘混合物孵育細(xì)胞 4-6小時洗掉轉(zhuǎn)染液，加入正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)24hLSCM觀察ControlHistaminewashout實例3 細(xì)胞膜磷脂PIP2的動態(tài)測定HEK293 cells expressing PLC-PH-GFPABoyi Liu, Huiling Liang, Li Liu and Hailin Zhang Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate hydrolysis mediates histamine-induced KCNQ/M current inhibition. Am J Physiol Cell Physiol. 2008 Zhanfeng Jia, Yueqin Jia, Boyi Liu, Zhiying Zhao, Qingzhong Jia, Huiling Liang and Hailin Zhang Genistein inhibits voltage-gated sodium currents in SCG neurons through protein tyrosine kinase-dependent