項目五 對流免疫電泳試驗

1、項目五 對流免疫電泳試驗項目五 對流免疫電泳試驗項目五 對流免疫電泳試驗V:1.0精細整理，僅供參考 項目五 對流免疫電泳試驗日期：20 xx年X月項目五 對流免疫電泳試驗(Counter immunoelectrophoresis test) 【實驗原理】 在適宜緩沖液和電場條件下，由于瓊脂凝膠中的抗原和相應抗體在電泳和電滲作用下能相對移動，所以二者會在加樣的兩孔之間相遇，并在它們濃度比例合適之處形成白色沉淀線。據(jù)此臨床常用該方法檢測抗原，以診斷某些疾病。 【試劑和器材】1AFP陽性血清、待檢血清、抗AFP診斷血清。 2 mol/L巴比妥緩沖液。 巴比妥鈉10.3 g 巴比妥 1.84 g先

2、將巴比妥置于三角燒瓶中，加入200ml蒸餾水，加熱溶解后再加入巴比妥鈉， 最后加蒸餾水至1000ml。3瓊脂凝膠按需要量稱取瓊脂粉，加入 L巴比妥緩沖液，使瓊脂濃度為12g/L，沸水浴中溶解至澄清。4電泳儀、電泳槽、萬用電表。5載玻片、繪圖筆尖、吸管、滴管等。 【步驟和方法】1制備瓊脂凝膠板取溶化的瓊脂34ml，澆于載玻片上，冷卻后打孔。 2打孔用繪圖筆尖按圖1-6打孔，孔徑約3mm，孔距45mm，挑去孔中凝膠。 3加樣用滴管按圖1-6分別加入抗血清、AFP陽性血清、待檢血清，以加滿孔為宜，注意不要溢出。 4電泳將加好樣的瓊脂凝膠板置于電泳槽中，抗原孔側置陰極端，抗體孔側置陽極端，兩端分別以2

3、3層濾紙或紗布搭橋，使凝膠和槽中緩沖液相接。按通電源，將電壓控制在46V/cm長，或電流34mA/cm寬，電泳3060min?！窘Y果判定】 電泳完畢后關閉電源，待1530min后取出瓊脂凝膠板觀察結果，或照相、染色后保存。陽性對照孔與抗血清孔之間必須出現(xiàn)沉淀線，否則試驗須重做。待檢血清孔與抗血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線為陽性，不出現(xiàn)者為陰性。1 陽性對照孔 24 待檢血清孔 圖1-6 對流免疫電泳【注意事項】 1當標本為脂血癥、陳舊血標本或由于2-巨球蛋白可引起假陽性，它靠近陽極呈弧狀。為排除這種假陽性可用參比電泳鑒別，即陽性對照孔與待檢孔間距為0.2cm，在兩孔中間相距0.4cm處打抗血清孔，加

4、樣后電泳，兩沉淀線吻合為陽性，相交為陰性，其它試驗條件與以上試驗相同。 2電泳緩沖液的pH值、離子強度、電壓和電泳時間對檢測結果均有影響，應注意控制。 3電泳時間隨孔間距的增大需適當延長。當兩孔距離為1cm時，電泳時間為2h；孔間距為0.6cm時，電泳時間為1h。 4抗原與抗體濃度比例應適當，可通過稀釋抗原適當調(diào)整，以免出現(xiàn)假陰性。 【方法評價】1簡便、快速，敏感度比雙相免疫擴散法高816倍。 2必須使用高特異性、高親合力的診斷抗體，否則結果難以解釋。 3必須選用有高電滲作用的瓊脂作支撐介質。 【臨床意義】 對流免疫電泳在臨床常用于定性檢測某些抗原，以對某些疾病或傳染病作快速診斷。也可用于抗原

5、的半定量測定，或根據(jù)沉淀線位置、形狀作抗原和抗體相對濃度的分析。由于該方法分辨率差，當有多種抗原抗體反應系統(tǒng)存在時，形成的沉淀線常重疊，而難以分辨，所以不用該方法作某種抗原或抗體組分的免疫化學分析。 【思考題】 1對流免疫電泳試驗原理如何為何選用高電滲作用瓊脂作為凝膠介質 2為何對流免疫電泳比雙相免疫擴散試驗敏感性高 項目六 火箭免疫電泳試驗(Rocket immunoelectrophoresis test) 【實驗原理】 抗原在含一定濃度抗體的瓊脂板一端，在電場作用下，向另一端泳動時抗原抗體復合物形成的沉淀呈圓錐形，狀似火箭而得名。它實質上是在電場作用下的凝膠內(nèi)單相免疫沉淀試驗。當抗體含量

6、不變時，沉淀峰的高度與抗原濃度成正比。因此用已知不同濃度標準抗原制成標準曲線，即可求出標本中抗原含量，所以又稱單相定量免疫電泳。 【試劑和器材】1 L巴比妥緩沖液。 230g/L緩沖瓊脂稱取3.0g瓊脂粉置250ml三角燒瓶中，加蒸餾水50ml，沸水浴中溶解，然后加入上述巴比妥緩沖液50ml混勻后，置3AFP診斷血清。4待檢樣品(臍帶血清或肝癌病人AFP陽性血清)。5參考血清(已知AFP標準抗原)。6電泳儀、電泳槽、37657載玻片、打孔器、微量加樣器等。 【步驟和方法】1取30g/L緩沖瓊脂，置水浴煮沸溶化，放2釋釋血清根據(jù)抗體的效價，用L巴比妥緩沖液將抗體作適當稀釋(一般作1:201:50

7、稀釋)，置523澆板將稀釋抗血清與30g/L緩沖瓊脂等量混合，注意保溫，防止產(chǎn)生氣泡(在水浴中操作，動作要輕緩)，用吸管吸取混勻瓊脂迅速滴加于載玻片上，每片瓊脂量。 載玻片要放在水平臺上，使?jié)沧⒌沫傊搴穸染鶆颉?打孔取冷凝后的瓊脂板，在距一端1.5cm處用打孔器等距離打3個孔，挑去孔內(nèi)瓊脂(圖1-7)。操作中防止孔四周出現(xiàn)裂紋或破損，否則將影響沉淀峰形狀，結果不準確。圖1-7火箭免疫電泳圖5加樣用微量注射器分別于孔內(nèi)準確地加入待檢樣品以及不同濃度的標準抗原各106電泳電泳槽內(nèi)盛L巴比妥緩沖液。將加好樣品的瓊脂板置于其上，抗原孔側放陰極端，用緩沖液浸濕的雙層濾紙兩端搭橋進行電泳。開始電壓為25

8、V/cm，維持1520min，然后增加到2530V/cm(需冷卻裝置)，電泳13h至完全成峰；或510V/cm過夜。7電泳結束后取下瓊脂板，如沉淀峰清晰即可直接判讀測量結果，否則可將瓊脂板浸泡于10g 【結果判定】1沉淀峰呈尖角火箭形則表示無游離抗原，泳動已到終點；如呈鈍圓形或沒有峰頂，前端云霧狀則表示還未到終點。2從抗原孔中心至火箭頂為沉淀峰高度。以已知標準抗原含量作橫坐標，沉淀峰的高度作縱坐標，繪制成標準曲線。根據(jù)待檢樣品沉淀峰的高度查標準曲線即可計算出待檢樣品中AFP的含量。 【注意事項】 1應選用低電滲作用的瓊脂糖作凝膠介質，可避免電滲作用所引起的某些標本的火箭峰倒退。2抗原過濃會使沉

9、淀峰無峰頂，看不到終點；抗體過濃則沉淀峰太低，降低試驗敏感度，甚至沉淀峰無法測量；抗體和抗原濃度應適宜。3為防樣品向四周擴散，加入樣品后應盡快電泳，或在電壓為23V/cm通過凝膠介質的情況下加入樣品，使結果判定更為準確。標本與標準抗原必須在相同的電泳條件下進行電泳。 4高壓電泳所需時間短，但需冷卻裝置。低壓電泳方便，峰形清晰，但需時較長。 5其它注意事項請參考單相免疫擴散試驗。 【方法評價】 火箭免疫電泳是在單相免疫擴散基礎上發(fā)展起來的技術，操作簡單，能定量，重復性較好。靈敏度同單相擴散，可測得g/ml以上的抗原含量，需時短是其優(yōu)點。為提高靈敏度，可用少量125I標記的標準抗原和被檢抗原共同電泳，在含抗體的瓊脂中形成不可見的火箭峰，經(jīng)洗滌干燥后，用X線膠片顯影，可出現(xiàn)同位素顯影的火箭峰，這就是目前采用較多的放射自顯影技術。根據(jù)放射自顯影示蹤的峰高即可計算出待檢抗原的含量，可測出ng/ml