臍血造血細(xì)胞體外集落培養(yǎng)最佳收獲時(shí)機(jī)的探討

1、臍血造血細(xì)胞體外集落培養(yǎng)最正確收獲時(shí)機(jī)的討論關(guān)鍵詞：基質(zhì)細(xì)胞;臍血;集落摘要:目的討論臍血B多系造血集落培養(yǎng)在不同培養(yǎng)條件下臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的最正確收獲時(shí)機(jī)。方法將從新穎B標(biāo)本中別離出的單個(gè)核細(xì)胞N分別接種于已建立的無(wú)血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基分別含單用人骨髓基質(zhì)細(xì)胞、單用細(xì)胞因子及細(xì)胞因子結(jié)合入骨髓基質(zhì)細(xì)胞HBS支持培養(yǎng)體系。在0、6、10及14d各時(shí)間點(diǎn)分別取細(xì)胞進(jìn)展巨細(xì)胞集落形成單位FU-K、紅系爆式集落形成單位BFU-E及粒單細(xì)胞集落形成單位FU-G培養(yǎng)。結(jié)果在體外培養(yǎng)過(guò)程中，第10d時(shí)各組FU-K、BFU-E及FU-G數(shù)均高于組內(nèi)其它時(shí)間點(diǎn)P0.05;在含HBS支持培養(yǎng)的組集落生成數(shù)優(yōu)

2、于其它組P0.05。結(jié)論臍血N體外培養(yǎng)過(guò)程中，第10d可能是收獲的最正確時(shí)機(jī)。FIBS能更好地維持造血干/祖細(xì)胞的活性，使其集落形成能數(shù)得到有效擴(kuò)增。關(guān)鍵詞:基質(zhì)細(xì)胞;臍血;集落bservatinntheptiutiefrharvestingheatpietiellsfrrdbldafterultureinvitr.Abstrat:bjetiveTexplretheptialtiefrharvestingrdbldheatpietiellsulturedinvitrbylnyulti-pliatin.ethdsnnulearellsseparatedfrrdbldereulturedinase

3、ru-freesystesuppleentedithy-tkinesrhuanbnearrstralellsfbinatinfthe.FU-K，BFU-EandFU-Gereassessedbyseislidultureassaynd0，d6，d10andd14frdeterinatinfprgenitrunber.ResultsThequantityfFU-K，BFU-EandFU-Gnd10afterultureeresignifiantlyhigherthanthatftherulturetieP0.05.Thenuberflnyfringunitserehigherinthegrups

4、supprtedithhuanbnearrstralellsP0.05.nlusinTheptialtiefrharvestingthennulearellsisnthetenthdayafterinvitrulturefrdbldheatpietiells.Bnearrstralellsisapablefaintainingtheativityfheatpietiellsulturedinvitr.Keyrds:Stralell;rdbld;lny臍血中造血干/祖細(xì)胞含量少，難以滿足大多數(shù)成人造血干細(xì)胞移植重建造血及免疫功能的需要，限制了其在臨床上廣泛應(yīng)用。通過(guò)體外培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)臍血造血細(xì)胞的有效

5、擴(kuò)增便成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵。目前，臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的培養(yǎng)體系多包含有不同的細(xì)胞因子組合和以骨髓基質(zhì)細(xì)胞為滋養(yǎng)層以及以骨髓基質(zhì)結(jié)合細(xì)胞因子等成分支持臍血體外擴(kuò)增。在前期的研究中證實(shí)1，以上三種方式都可以使臍血造血細(xì)胞得到有效擴(kuò)增，其中以第三種效果最好，但是造血細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中不可防止地產(chǎn)生過(guò)分化的現(xiàn)象，造成造血細(xì)胞體內(nèi)移植才能的減弱。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察擴(kuò)增后造血干/祖細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)各系集落形成才能的變化，尋找臍血體外培養(yǎng)收獲細(xì)胞的最正確時(shí)機(jī)。1材料和方法1.1人骨髓基質(zhì)細(xì)胞層的建立無(wú)菌條件取出正常成人供者骨髓液約56l，經(jīng)淋巴細(xì)胞別離液聚蔗糖一泛影葡胺，比重為1.077，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血

6、液研究所密度梯度離心制成單個(gè)核細(xì)胞N懸液，接種于含15%FBS，100kU/I青霉素，100g/L鏈霉素的ID培養(yǎng)體系中。細(xì)胞接種濃度為2106/l，2d后全量換液，以后每周半量換液2次，培養(yǎng)1014d，基質(zhì)細(xì)胞層交融約80%后，經(jīng)15Gy60照射備用。1.2臍血N液體培養(yǎng)體系無(wú)菌采集正常足月妊娠安康產(chǎn)婦的臍血10例，ADA抗凝，新穎臍血按4:1體積比參加羥乙基淀粉3045in去除沉淀的紅細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞別離液密度梯度離心別離山N懸液備用。無(wú)血清培養(yǎng)體系為StespanT培養(yǎng)液Steell公司產(chǎn)品。參加細(xì)胞因子SF、FL及TP濃度均為40ng/l英國(guó)Peprteh公司。臍血N接種濃度為1106

7、/l。實(shí)驗(yàn)分組如下:A、對(duì)照組:無(wú)細(xì)胞因子及HBS;B、培養(yǎng)液中含HBS:、培養(yǎng)液中僅含細(xì)胞因子:D、培養(yǎng)液中同時(shí)含細(xì)胞因子及HBS，種入252培養(yǎng)瓶于37，體積濃度為5%2的全濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d，分別在d6、d10及d14半量換液，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)并取出細(xì)胞進(jìn)展半固體集落培養(yǎng)。1.3臍血造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)前臍血N及每次換液細(xì)胞進(jìn)展FU-K、FU-G及BFU-E集落培養(yǎng)。BFU-E及FU-G用半固體ethultTGFH4434Steell公司培養(yǎng)基，含1%甲基纖維素，30%FBS，i%BSA，10-42-E，50ng/lrhSF，50ng/lG-SF，10ng/lrhlL-3，3U/lrh

8、EP，細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)14d后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各種集落數(shù)，顯微鏡下以含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)為一個(gè)集落;FU-K用ethultT-試劑盒含無(wú)血清培養(yǎng)液、膠原及與D41結(jié)合的原位APAAP染色系統(tǒng)檢測(cè)，詳細(xì)操作方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)展。1.4統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS11，0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，以P0.05為差異有顯著性。2結(jié)果本實(shí)驗(yàn)所用半固體培養(yǎng)基ethultTGFH4434可支持FU-G及BFU-E等集落生長(zhǎng)，接種第12d倒置顯微鏡下觀察仍為分散的單個(gè)細(xì)胞，第3d開(kāi)場(chǎng)增殖，起初為幾個(gè)細(xì)胞叢，第7d后可見(jiàn)集落，714d集落不斷增多，14d后集落逐步減少，集落形成單位為含50個(gè)以上細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)

9、，其中FU-GU為無(wú)色的細(xì)胞團(tuán)，有的呈密集型集落，有的呈疏散型;BFU-E為粉紅色集落，集落內(nèi)細(xì)胞完好，細(xì)胞間嚴(yán)密相連。FU-NK經(jīng)固定及染色后為呈粉紅色胞膜，淡藍(lán)色核的細(xì)胞群體，而非巨核系集落或細(xì)胞簇那么僅核著色，呈淡藍(lán)色。3個(gè)以上巨核細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)稱為FU-K。各組不同時(shí)間點(diǎn)集落形成單位體外擴(kuò)增數(shù)，見(jiàn)表1。表1A組培養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)各集落形成單位體外擴(kuò)增數(shù)/105個(gè)N略注:各集落形成單位內(nèi)d0與d6、d10及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d6與d10及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d10與d14比擬時(shí)，P0.05。表2B組培養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)各集落形成單位體外擴(kuò)增數(shù)/105

10、個(gè)N略注:各集落形成單位內(nèi)d0與d6、d10及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d6與d10及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d10與d14比擬時(shí)，P0.05。表3組培養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)各集落形成單位體外擴(kuò)增數(shù)/105個(gè)N略注:各集落形成單位內(nèi)d0與d6、d10及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d10與d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d0與d10比擬時(shí)，P0.05，與d6及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d6與d10比擬時(shí)，P0.05，與d14比擬，P0.05。表4D組培養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)各集落形成單位體外擴(kuò)增數(shù)/105個(gè)N略注:各集落形成單位內(nèi)d0與d6、

11、d10及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d6與d10及d14比擬時(shí)，P0.05;各集落形成單位內(nèi)d10與d14比擬時(shí)，P0.05。A組對(duì)照組在體外培養(yǎng)過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其各集落形成才能不斷下降，到第14d時(shí)已無(wú)集落生長(zhǎng);B、及D組在體外培養(yǎng)的前10d中，其各系集落形成單位數(shù)不斷增加，第10d后開(kāi)場(chǎng)下降，第10d時(shí)各系集落單位數(shù)優(yōu)于其它時(shí)間點(diǎn)P0.05。另外，統(tǒng)計(jì)分析說(shuō)明，含HBS支持培養(yǎng)的B、D兩組在培養(yǎng)后的各時(shí)間點(diǎn)其BFU-E、FU-G及FU-K數(shù)均較無(wú)HBS支持的組好P0.05。3討論臍血體外擴(kuò)增是解決臍血絕對(duì)數(shù)量缺乏的關(guān)鍵，目前研究指出，臍血造血細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)

12、胞總數(shù)和造血祖細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，但另一方面，在培養(yǎng)過(guò)程中，造血干祖細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生分化，造成造血細(xì)胞活性下降及植入才能降低。因此，改良并優(yōu)化現(xiàn)有的培養(yǎng)體系是目前研究的熱點(diǎn)之一。目前研究臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的培養(yǎng)體系多包含有不同的細(xì)胞因子組合、以骨髓基質(zhì)細(xì)胞為滋養(yǎng)層以及以骨髓基質(zhì)結(jié)合細(xì)胞因子等成分。本實(shí)驗(yàn)采用以上三種培養(yǎng)體系對(duì)臍血造血細(xì)胞進(jìn)展體外擴(kuò)增，討論其對(duì)各種集落形成單位的擴(kuò)增才能及收獲細(xì)胞的最正確時(shí)機(jī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在體外培養(yǎng)第10d時(shí)，BFU-E、FU-G及FU-K分別由原來(lái)的87.3073.3/105個(gè)N、121.0018.84/105個(gè)N、48.003.00/105個(gè)N增加到最高806.

13、90196.73/105個(gè)N、515.40189.11/105個(gè)N、457.5679.32/105個(gè)N，各組第10d時(shí)各集落形成單位數(shù)均優(yōu)于其它時(shí)間點(diǎn)P0.05，第10d后集落形成才能減低，說(shuō)明體外培養(yǎng)臍血造血祖細(xì)胞數(shù)在第10d到達(dá)最高值，體外培養(yǎng)最正確收獲時(shí)機(jī)應(yīng)在第10d左右，與國(guó)內(nèi)莫文健2等的報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明，單用細(xì)胞因子組合支持臍血造血細(xì)胞體外培養(yǎng)，其擴(kuò)增倍數(shù)不如用人骨髓基質(zhì)細(xì)胞支持的好，這可能與單用細(xì)胞因子支持培養(yǎng)容易造成造血干祖細(xì)胞分化成熟有關(guān)，細(xì)胞因子組合結(jié)合人基質(zhì)細(xì)胞支持臍血進(jìn)展體外擴(kuò)增，能局部抵消由細(xì)胞因子啟動(dòng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)啟始細(xì)胞的分化，使造血祖細(xì)胞在得到大量擴(kuò)增的同時(shí)能保持造血干細(xì)胞的活性3。參考文獻(xiàn):1angai-xia，aPing，LinXiu-Ei，etal.ExvivexpansinfrdbldnnulearellssupprtedbyhuanbnearrstralellsJ.hinJrganTransplant，2022，2610:616618.2en-jian，aPing，HeQiu-shan，etal.Exvivexpansinfegakaryyteprgenitrellsfrhuanrdbldinseru-freeul