臨床ELISA的基本原理共32張課件

1、臨床ELSA的基本原理和方法臨床ELSA的基本原理和方法EL|SA的基本原理EL|SA是指以酶作為標(biāo)記物、以抗原和抗體之間免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測定方法。因此,一個ELISA測定試劑,其有機(jī)組成部分包括:(1)包被的抗原或抗體的固相支持物,即聚苯乙烯塑料微孔或試管;(2)酶標(biāo)記的抗體或抗原和(3)酶的反應(yīng)底物等。抗原或抗體的固相化,并不影響其免疫結(jié)合活性,酶標(biāo)記的抗體或抗原亦是如此,并且標(biāo)記酶的活性不因標(biāo)記過程而喪失。整個測定中,抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行,反應(yīng)結(jié)果的判斷,以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn),顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光的強(qiáng)度,與臨床標(biāo)本中待測物的濃度

2、成正比或反比關(guān)系。目前國內(nèi)的ELSA試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來完成測定EL|SA的基本原理固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué)通常所提到的抗原與抗體的相互作用一般指的是在液相狀態(tài)下,而在固相狀態(tài)下,抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)有其相應(yīng)的特點(diǎn),主要表現(xiàn)在以下四個方面。固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué))固相上抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時間較液相狀態(tài)下長通常,固相免疫測定如ELSA中,抗原與抗體結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時間,較液相免疫測定要長,并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當(dāng)在微孔板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測定時,界面反應(yīng)動其對擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴性,擴(kuò)散性越強(qiáng),則反應(yīng)所需時間越短,結(jié)合越充分。這一

3、點(diǎn)可通過旋轉(zhuǎn)振蕩來達(dá)到,微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進(jìn)入到可與抗體或抗原包被的界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。也可在微孔中放性的塞子以使反應(yīng)液體成為個小體積,或使用一個具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纟維素,或使用微顆粒來做到這一點(diǎn)。微顆粒小于1m時,在測定時即成膠體懸液,而當(dāng)顆?；蛑檩^大時,則會在沒有振蕩時,由于重力的作用而分開。所有上述方法均是通過減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比,從而減少固相免疫測定的擴(kuò)散依賴)固相上抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時間較液相狀態(tài)二)固相上抗原與抗體接觸表面的反應(yīng)體積遠(yuǎn)小于液相測定此處的反應(yīng)體積并非是微孔中的液體體積,而是固相免疫測定中與固相包被的抗體或抗原有接觸

4、的部分,這部分體積到底有難測定,但比反應(yīng)液體體積要少得多。相抗原抗體反應(yīng)發(fā)生于液體相界能處于一級結(jié)合鍵的引力距離內(nèi),小于100A。液相中待測抗原或抗體要進(jìn)入到這個結(jié)合界面,需要經(jīng)過擴(kuò)散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。微顆粒的反應(yīng)表面區(qū)域較微孔要大得多,因而處抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應(yīng)體積的比例亦高得多。反應(yīng)的效率更這也是全自動化免疫測定分析儀均采用微顆粒固相的重要原可參與結(jié)合反應(yīng)的抗體或抗原的濃度取決于可參與結(jié)合的反應(yīng)體積反應(yīng)體積,從而難以使用通常的質(zhì)量作用抗體反應(yīng)的Keq值與液相抗原與抗體反應(yīng)的Keq值沒有可比性二)固相上抗原與抗體接觸表面的反應(yīng)體積遠(yuǎn)小于液相(三)固相上抗原和抗體間結(jié)合后的離解速率較液相測

5、定低固相免疫測定中固相表面上抗原和抗體間的相互作用,類似于細(xì)胞表面上蛋白與其受體間的結(jié)表明,細(xì)胞表面上的蛋白與受體結(jié)應(yīng)的離免疫測定涉及到細(xì)胞表面受體的聚由于多價(jià)復(fù)合物離解的減合力增加。研想的拉原和體也是成簇或集的離解呔其結(jié)僉所需的能昰要大表明在初始結(jié)拿鍵形成后,又形成了恣級結(jié)的和來或抗原,常以很高的濃度使抗原和抗體有離解發(fā)較液種極緩慢的使得ELSA和固相免疫測測定的反復(fù)洗滌步驟,也可使受體配體保持處于結(jié)合狀態(tài)。(三)固相上抗原和抗體間結(jié)合后的離解速率較液相測定低(四)微孔內(nèi)特異抗體免疫測定的親和力依賴性使用固相包被的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測定,與液相測定相互作用的穩(wěn)定微孔內(nèi)特異抗體的

6、免疫測定親和力依賴性和極抗原濃度極附的抗原因?yàn)樽冃曰蚩臻g位阻而致抗原表位喪失的結(jié)由于固相吸附發(fā)異拉體與甚結(jié)倉的親和/m濃度被動吸的60-80%的吸在固相就500-800ng抗m抗體的血清的000稀釋可提供大于10倍過量的吸附限性,不能解結(jié)合的低親和力,而更可能是由于的喪失所致(四)微孔內(nèi)特異抗體免疫測定的親和力依賴性(五)固相的抗體或抗原與液相中的抗體或抗原在構(gòu)型上不一樣固相化的抗體或抗原可能與液相中的抗體或抗原所展示的構(gòu)型不一樣,對抗體或抗原由于固相化尤其是被動吸附或其它吸附方式所致的構(gòu)型改變已有眾多的文獻(xiàn)報(bào)道(五)固相的抗體或抗原與液相中的抗體或臨床ELsA測定的常用模式ELSA依其測定抗

7、原和抗體的不同,測定模式有很多,如直接法、間接法、雙抗體夾心法(直接、司接)、競爭抑制法(直接、夾心等)、捕獲法等4。在臨床實(shí)驗(yàn)室,常用的ELSA測定模式有雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、競爭抑制法和捕獲法等。在抗原的測定上,蛋白大分子抗原測定用的最多的模式是雙抗體夾心法,而對只有單個抗原表位的小分子,則使用競爭抑制法抗體的測定通常使用間接法、雙抗原夾心法、競爭抑制法和捕獲法等。臨床ELsA測定的常用模式(一)抗原測定ELSA模式1.雙抗體夾心法對于含多個抗原表位的大分子蛋白,使用雙抗體lSA模式測定相當(dāng)簡便,現(xiàn)有的測蛋白抗原的商品試劑盒基本上都采用此種測定模式。具體測定方法如下。(1)首

8、先以雙抗體之一于碳酸鹽緩沖液中28下過夜包被聚苯乙烯固相,形成固相洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉,洗滌去除未結(jié)合的部分及雜(2)加入含待測物的臨床樣本如血清(漿)等,溫育(通常為37后,洗板;此時,待測抗原就會與固相上特異抗體結(jié)合而吸附于固相(3)加入酶標(biāo)記的雙抗體溫育(通常為37定時間后洗板;此時,在固相上即形成雙抗體與特異抗原的夾心產(chǎn)物。(4)加入酶底物,溫育(通常為37下)顯色測定(一)抗原測定ELSA模式臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基本原理共32張課件臨床ELISA的基