抗植物病蟲害基

關(guān)于抗植物病蟲害基第1頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

第一章抗植物病蟲害基因

及其應(yīng)用第一節(jié)抗植物蟲害基因及其應(yīng)用第二節(jié)抗植物病毒基因及其應(yīng)用第三節(jié)抗植物真菌病害基因及其應(yīng)用第四節(jié)抗植物細(xì)菌病害基因及其應(yīng)用

第2頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四第一節(jié)概述一、作用及意義二、抗性基因的來源三、抗性基因分類

第3頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四一、作用及意義

應(yīng)用抗病蟲害基因具有以下優(yōu)勢：

1.

育種周期短、效率高、成本低。

2.

提高產(chǎn)量和品質(zhì)。

3.降低生產(chǎn)成本。

4.

防止化學(xué)農(nóng)藥污染，避免破壞生態(tài)平衡。

5.

克服親本基因資源缺乏。

6.抗性性狀具有連續(xù)性和整體性。第4頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四二、抗性基因的來源

根據(jù)基因來源分為三類：

1.植物組織如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。2.動(dòng)物如殺菌肽（cecropins）基因。3.微生物如Bt殺蟲結(jié)晶蛋白基因。

第5頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

三、抗性基因分類據(jù)基因的作用功能和對象分為：

1.抗蟲基因。

2.抗病毒基因。

3.抗真菌和細(xì)菌基因。

第6頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四第二節(jié)抗植物蟲害基因及其應(yīng)用

一、Bt基因及其應(yīng)用二、蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用三、植物凝集素基因及其應(yīng)用四、淀粉酶抑制劑基因及其應(yīng)用

第7頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四一、Bt基因及其應(yīng)用

Bt基因的作用原理2.ICP的分類、結(jié)構(gòu)及抗蟲譜Bt基因的應(yīng)用4.存在的問題及對策

第8頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1.Bt基因的作用原理Bt基因：是從微生物蘇云金桿菌（Bacillusthu-ringicnsis）分離出的蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因，簡稱Bt基因。蘇云金桿菌屬于革蘭氏陰性，形成孢子細(xì)菌。在芽胞形成過程中，可產(chǎn)生伴胞晶體，它由一種或多種蛋白組成，具有高度特異性殺蟲活性，這種蛋白通常被稱作δ-內(nèi)毒素（δ-endotoxins）或殺蟲結(jié)晶蛋白（in-secticidalcrysta1protein，ICP）。

第9頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四作用原理：

ICP通常以原毒素（protoxin）形式存在，當(dāng)昆蟲取食ICP后，原毒素在昆蟲的消化道內(nèi)被活化，轉(zhuǎn)型為毒性多肽分子?；罨腎CP與昆蟲腸道上皮細(xì)胞上的特異性結(jié)合蛋白結(jié)合，全部或部分嵌合于細(xì)胞膜中，使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道，細(xì)胞因滲透平衡糟破壞而破裂。導(dǎo)致昆蟲幼蟲停止進(jìn)食，最終死亡。

第10頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四ICP的活化過程：首先ICP溶解在昆蟲的腸道里（ICP在堿性條件可溶，而在中性條件下不溶），然后，在蛋白酶的作用下，通過專一性蛋白酶水解切割，ICP被活化?；罨腎CP不被胰蛋白酶或其它蛋白酶破壞。第11頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四2．ICP的分類、結(jié)構(gòu)及抗蟲譜

據(jù)抗蟲譜和序列同源性分為四種類型：類型I（CryI）抗鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲，對其幼蟲有特異的毒性作用。類型II（CryII）抗鱗翅目和雙翅目（Diptera）。類型III（CryIII）

抗鞘翅目（Coleoptera）昆蟲。類型IVw（CryIV）抗雙翅目（Diptera）昆蟲。第12頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

類型V（CryV）抗鱗翅目和鞘翅目。

近年P(guān)ayne等人則發(fā)現(xiàn)了具有抗膜翅目（Hymeno-ptera）以及抗線蟲（Nematodes）的ICP。第13頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四在每種主要類型中，據(jù)序列同源性，ICP又劃分為若干亞類例如，CryI又分為IA(a)、IA(b)、IA(c)、IB、IC等。第14頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四ICP的結(jié)構(gòu)CryＩ蛋白為長1100～1200個(gè)氨基酸的多肽，大小為130～140kD，其毒性多肽分子是約60～70kD的核心片段。活性區(qū)在氨基端，而原毒素羧基端至少一半以上的氨基酸序列沒有毒性功能。第15頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四只保留編碼毒性核心片段的核苷酸序列就能達(dá)到抗蟲目的。如，Bt2編碼的最短毒性片段位于29至607氨基酸殘基處，進(jìn)一步從基因3′端刪除4個(gè)密碼子（codon）或從5′端刪除8個(gè)密碼子，將完全喪失產(chǎn)物的毒性功能。第16頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四3.Bt基因的應(yīng)用

1987年比利時(shí)的Vacek等人利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株。他們使用全長的CryIA（b）基因編碼1155個(gè)氨基酸和該基因保留了5ˊ端編碼毒蛋白核心區(qū)域的缺失片段（編碼610個(gè)氨基酸）。轉(zhuǎn)基因植株對煙草天蛾（ManducaSexta）幼蟲的抗性為75％～100％。

第17頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四美國Monsanto公司的Fischhoff等人（1987年）獲得轉(zhuǎn)Bt基因的番茄植株。他們用帶有CaMV35S啟動(dòng)子的CryIA(b)基因轉(zhuǎn)化番茄品系VF36。獲得了對煙草天蛾顯示出高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因植株。但因ICP表達(dá)水平低，對番茄果螟（Heliothisvirescens）的抗性不強(qiáng)。第18頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

目前全世界已有許多不同類型的ICP基因轉(zhuǎn)入多種作物，如煙草、番茄、玉米、棉花、水稻、蘋果、核桃等。第19頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

研究結(jié)果表明：一般用全長CryIA基因轉(zhuǎn)化植物，ICP在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)量很低，甚至檢測不到，其抗蟲效果差或不具抗蟲性。在高抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植株中，每毫克可溶性蛋白中約有2.6～190ng的ICP。第20頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四4.

存在的問題及對策（1）ICP在植物中表達(dá)水平低（2）昆蟲對ICP產(chǎn)生抗性（3）抗菌譜窄第21頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（1）ICP在植物中表達(dá)水平低

原因：

主要是mRNA不穩(wěn)定和翻譯效率低。天然的Bt基因富含A、T堿基,而植物基因富含G、C堿基,可能導(dǎo)致Bt基因轉(zhuǎn)錄的末成熟終止（prematuretranscriptiontermination）及不適當(dāng)?shù)那懈?。因密碼子上的差異也可能使Bt基因在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程中形成二級結(jié)構(gòu)、mRNA的特定序列被降解和翻譯效率降低。第22頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

為提高富含A、T堿基的Bt基因在富含G、Ｃ堿基的植物細(xì)胞中表達(dá)水平。有人對CryI基因進(jìn)行了部分甚至完全的修飾。修飾后的CryI基因在轉(zhuǎn)基因棉花、煙草、番茄和玉米中的表達(dá)水平有了顯著提高。對策1：修飾Bt基因，改造密碼子。第23頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

Monsanto公司的Per1ak等人在不改變氨基酸序列的情況下，對CryIA(b)和CryIA(c)基因進(jìn)行修飾（主要是去除富含A、T堿基序列），使CryIA(b)和CryI(c)的表達(dá)水平提高了100倍，CryIA(b)和CryI(c)蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的0.05％～0.1％，獲得良好的抗蟲效果，其中轉(zhuǎn)基因棉花植株對棉鈴蟲（Heliothisarmingera）的抗性達(dá)80％。第24頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四對策2：使用新啟動(dòng)子（包括組織

特異性啟動(dòng)子）Koziel等人合成了一個(gè)富含G,C堿基的CryIA(b)基因，該合成基因編碼CryIA(b)的部分氨基酸，與野生型CryIA(b)基因只有65％的同源性。并用適合在玉米中表達(dá)的密碼子替代原細(xì)菌密碼子。

第25頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

利用基因槍把該基因?qū)胗衩灼贩N。使用3種啟動(dòng)子：1.CaMV35S啟動(dòng)子。2.玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)啟動(dòng)子。3.玉米花粉特異性啟動(dòng)子調(diào)控。后兩種啟動(dòng)子調(diào)控下的CryIA(b)基因在轉(zhuǎn)基因玉米植株中顯示出明顯的組織特異性。即在綠色組織中，CryIA(b)基因強(qiáng)烈表達(dá)，占可溶性蛋白0．1％～0.4％。第26頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四對策3：尋找新一代啟動(dòng)子

除組織特異性啟動(dòng)子外，研究人員也尋找第二代啟動(dòng)子來提高ICP基因的表達(dá)水平。例如,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動(dòng)子和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可以使轉(zhuǎn)基因煙草中的CryIA(ｃ)表達(dá)量提高10-20倍。第27頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（2）昆蟲對ICP產(chǎn)生抗性

對策1：使用組織專一性或化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子。

使用組織專一啟動(dòng)子，可使Bt基因的表達(dá)局限在植物重要的組織。第28頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

例如，只在棉花的棉鈴中表達(dá)，末經(jīng)選擇的害蟲能在葉片上存活。病原相關(guān)蛋白（pathogen-sis-relatedprotein,即PR蛋白）是植物受到病原物侵染或其它刺激時(shí)表達(dá)的一組蛋白。PR-la是編碼其中一種PR蛋白的基因,可因侵染而被誘導(dǎo),也可被一些化學(xué)刺激物(包括水楊酸和聚丙酰酸)誘導(dǎo)。第29頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

目前，CIBA的研究小組已經(jīng)獲得帶PR-la啟動(dòng)子調(diào)控Bt基因的轉(zhuǎn)基因煙草。

用化學(xué)藥劑處理該基因煙草，它對煙草天蛾產(chǎn)生抗性。因此采用上述化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的方法可以調(diào)控Bt基因在化學(xué)誘導(dǎo)劑存在下才能表達(dá),從而降低抗性的選擇壓產(chǎn)生,以防止抗性擴(kuò)散。

第30頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四對策2：修飾Bt基因,使ICP在植物中

高劑量表達(dá)。

迄今，目前發(fā)現(xiàn)的高水平的Bt抗性基因都是隱性基因,而且ICP對害蟲的幼蟲特別有效,所以Bt基因的連續(xù)、高劑量表達(dá)，可以消除突變雜合體。第31頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四對策3：使用兩種以上的Bt基因或Bt

與其它抗蟲基因結(jié)合使用。

除非抗性位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率很高和毒蛋白劑量低到雜合體可以存活，否則昆蟲幾乎不可能對兩種獨(dú)立殺蟲蛋白同時(shí)產(chǎn)生耐受性。

第32頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四對策4：將轉(zhuǎn)與非轉(zhuǎn)基因的植株混種

在繁育群體中保留一部分末經(jīng)選擇的害蟲，防止害蟲對Bt基因的抗性擴(kuò)散。

第33頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（3）抗菌譜窄

對策：采用多基因?qū)氩呗?，利用基因之間的協(xié)同擬菌作用，向植物體內(nèi)同時(shí)導(dǎo)入多個(gè)基因。第34頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四二、蛋白酶抑制劑（PI）基因

及其應(yīng)用

1.PI基因的抗蟲原理2.PI的分類及抗蟲譜3.PI基因的應(yīng)用

第35頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四是一類蛋白質(zhì)，在植物防御昆蟲和病原體侵染的天然防御系統(tǒng)中起著重要作用，具有明顯的抗蟲作用的蛋白質(zhì)。PI基因的抗蟲譜廣泛，可抗幾個(gè)目的昆蟲。

蛋白酶抑制劑（proteinasein-

hibitor,PI）：第36頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

PI存在于自然界的所有生命體中，在大多數(shù)植物的種子和塊莖中的含量可高達(dá)總蛋白的1％-10％。在有些果實(shí)中絲氨蛋白酶抑制劑的含量可達(dá)總蛋白的30％。

第37頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1.PI基因的抗蟲原理（1）PI與昆蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶相結(jié)合，形成酶抑制劑復(fù)合物（EＩ），從而阻斷或減弱蛋白酶對于外源蛋白質(zhì)的水解作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能被正常消化。第38頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（2）EI復(fù)合物能刺激昆蟲過量分泌消化酶，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)。停止進(jìn)食而缺乏代謝所需的一些氨基酸，導(dǎo)致昆蟲發(fā)育不正常或死亡。第39頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（3）蛋白酶抑制劑分子可能通過消化道進(jìn)入昆蟲的血淋巴系統(tǒng)，從而嚴(yán)重干擾昆蟲的蛻皮過程和兔疫功能，以致昆蟲不能正常發(fā)育。第40頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四PI的作用特點(diǎn)：（1）PI作用于蛋白消化酶的活性中心?；钚灾行氖敲缸畋Ｊ氐牟课?，產(chǎn)生突變的可能性極小，故可以排除害蟲通過突變產(chǎn)生抗性的可能性。第41頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（2）PI對于人、畜無害，因人、畜與昆蟲的消化機(jī)理明顯不同。人、畜的蛋白消化酶主要存在于腸道中，而PI在胃中的酸性條件下，被胃蛋白酶分解。第42頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四2.PI的分類及抗蟲譜

植物中存在三類：（1）絲氨酸蛋白酶抑制劑（2）巰基蛋白酶抑制劑（3）金屬蛋白酶抑制劑

第43頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（1）絲氨酸類蛋白酶抑制劑大多數(shù)昆蟲所利用的蛋白消化酶是絲氨酸類蛋白消化酶，特別是類胰蛋白酶，因此抗蟲效果明顯，

絲氨酸類蛋白酶抑制劑有6種，最有效的有，豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）和馬鈴薯蛋白酶抑制劑（patatoinhibitor，PI）

第44頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）：

抗蟲譜廣泛，抗蟲效果最理想。抗鱗翅目、鞘翅目、直翅目。第45頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四CpTI是由80個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，分子中富含二硫鍵，它的一個(gè)分子具有兩個(gè)抑制活性中心。CpTI與胰蛋白酶緊密結(jié)合，使酶活性中心失活。第46頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四馬鈴薯蛋白酶抑制劑

（patatoinhibitor，PI）：有2類：PI-I家族和PI-II家族

第47頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四PI-I家族：

包括馬鈴薯和番茄蛋白酶抑制劑I，其成熟肽單體分子量為8.1kD，只有一個(gè)活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶

第48頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四PI-II家族：

包括馬鈴薯和番茄蛋白酶抑制劑II，其成熟肽單體分子量為12.3kD，有兩個(gè)活性中心，可分別抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋肉酶。

PI-II比PI-I抗蟲效果好。對煙草天蛾等一齡幼蟲抗性明顯。第49頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四（2）巰基蛋白酶抑制劑對利用巰基蛋白酶消化植物蛋白的昆蟲具有特殊抗性。水稻巰基蛋白酶抑制劑（oryzacystatin）是抗蟲能力較強(qiáng)的一種PI。其基因序列內(nèi)有兩個(gè)內(nèi)含子，cDNA編碼102個(gè)氨基酸的小肽，分子量約為１1．5kD，分子中部第52位后的Ｇln-Val-Val-Ala-Gly具有高度保守性,該保守區(qū)對于維持抑制劑活力是必要的。第50頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四3.蛋白酶抑制劑基因的應(yīng)用

1987年，英國Durham大學(xué)的Hilder等把編碼CpTI的cDNA轉(zhuǎn)移到煙草品種Sam-sunNN中，首先獲得轉(zhuǎn)CpTI基因的工程植株。第51頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四該cDNA長550bP，由CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控。獲得的煙草轉(zhuǎn)基因植株能夠正確表達(dá)CpTI基因，有的轉(zhuǎn)基因植株中CpTI的表達(dá)量高達(dá)9.6μg／mg可溶性蛋白。而CpTI的表達(dá)量達(dá)到5μg／mg可溶性蛋白時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株就表現(xiàn)出明顯的抗蟲性。第52頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四目前已把CpTI基因轉(zhuǎn)移到許多有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物中，如，水稻、油菜、白薯、蘋果和楊樹等。

第53頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

目前已經(jīng)有許多種蛋白酶抑制劑的基因或cDNA被克隆，其中有些表現(xiàn)出明顯的抗蟲作用。CpTI基因、PI-II基因和水稻巰基蛋白酶抑制劑基因是植物抗蟲基因工程中應(yīng)用最廣、研究較深入的蛋白酶抑制劑基因。

第54頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四提高PI基因表達(dá)水平的對策：

深入研究基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理。使用特定啟動(dòng)子修飾蛋白酶抑制劑基因。

第55頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四中科院遺傳研究所利用不同的啟動(dòng)子和Ω因子對CpIT基因進(jìn)行修飾，得到不同的植物表達(dá)質(zhì)粒。其中Ω因子來自煙草花葉病毒（TMV）126kD蛋白基因轉(zhuǎn)錄序列5ˊ未端的非轉(zhuǎn)譯區(qū)，由68bp組成，能夠促進(jìn)mRNA翻譯。利用CaMV35S啟動(dòng)子串聯(lián)Ω因子調(diào)控的CpTI基因轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因煙草中CpTI的表達(dá)顯著提高，但高效表達(dá)易引起轉(zhuǎn)基因煙草的白化。第56頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四三、植物凝集素基因及其應(yīng)用1.基本特性2.主要種類3.抗蟲原理4.基因的應(yīng)用

第57頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1.基本特性

植物凝集素（lectin）是非兔疫來源的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白質(zhì)(sugar-bindingprotein)，它們能聚集細(xì)胞和（或）沉淀糖蛋白。主要存在于細(xì)胞的蛋白粒中。第58頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

最主要的特性是能和糖類結(jié)合。多數(shù)是一些寡聚蛋白,二聚體或四聚體，少數(shù)含有兩個(gè)糖結(jié)合部位的單體，如蓖麻毒蛋白。植物凝集素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)有許多相似性。第59頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

許多植物凝集素的一級結(jié)構(gòu)、凝集素與配體結(jié)合物的三維立體結(jié)構(gòu)或基因結(jié)構(gòu)被測定。凝集素廣泛存在于植物界，在各種組織器官中均有發(fā)現(xiàn)，尤以豆科植物的種子中含量最為豐富。第60頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四2.主要種類

（1）麥胚凝集素（wheatgermagg1utinin，ＷGA）（2）雪花蓮（Galanthusnivalis，GNA）凝集素（3）豌豆外源凝集素（pea-lectin,p-Lec）

第61頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四麥胚凝集素：是禾本科中典型的植物凝集素，有三種WGAＩ、WGAII和WGAIII，氨基酸組成相近。分子中甘氨酸和半胱氨酸含量很高，極性氨基酸的含量很低，不含糖。

第62頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四雪花蓮：一級結(jié)構(gòu)、生物合成以及基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚，由105個(gè)氨基酸殘基組成的成熟蛋白，包括3個(gè)重復(fù)性同源片段，每個(gè)約25個(gè)氨基酸殘基。對于蚜蟲、葉蟬、稻褐飛虱等同翅目吸食性害蟲具有極強(qiáng)的毒性，也能控制蚜蟲一類的吸汁性害蟲。

第63頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四豌豆外源凝集素：由275個(gè)氨基酸的組成的蛋白質(zhì)。有活性的豌豆外源凝集素由以α和β兩個(gè)亞基組成。能抑制豇豆象的生長。

第64頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四3.抗蟲原理當(dāng)被昆蟲取食后，外源凝集素在昆蟲的消化道中與腸道圍食膜上的糖蛋白專一性結(jié)合（即不同的外源凝集素與相應(yīng)的糖類結(jié)合），從而影響營養(yǎng)的吸收?？赡茉诶ハx的消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，促進(jìn)消化道中細(xì)菌的繁殖。

第65頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四4.植物凝集素基因的應(yīng)用

上述凝集素等的編碼基因已經(jīng)分離，并被成功地導(dǎo)入煙草和萵苣等植物中。用CaMV35S啟動(dòng)子或水稻蔗糖合成酶基因啟動(dòng)子調(diào)控，轉(zhuǎn)基因煙草對蚜蟲表現(xiàn)出明顯抗性。第66頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四Bou1ter等（1991）豌豆凝集素基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株再與轉(zhuǎn)CpTI基因植株雜交，獲得了既能表達(dá)豌豆凝集素又能表達(dá)CpTI的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草，其抗蟲能力顯著提高。這也表明了基因間的協(xié)同作用有可大大提高作物的抗性。

第67頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四Maddock等（1990）用基因槍轉(zhuǎn)化玉米胚性懸浮系，獲得的表達(dá)麥胚凝集素基因的轉(zhuǎn)化植株對歐洲玉米螟具有良好的抗性。存在的問題：轉(zhuǎn)基因植株是否對人、畜無害，還有待證實(shí)。

第68頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四四、淀粉酶抑制劑基因及其應(yīng)用

1.基本特性2.抗蟲原理3.應(yīng)用第69頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1.基本特性

淀粉酶抑制劑（α-amylaseinhibitor，α-AI）是植物界普遍存在的一類蛋白質(zhì)，它能抑制哺乳動(dòng)物及昆蟲體內(nèi)的α-淀粉酶的活性，阻斷對攝取食物中淀粉成分的消化。α-AI對植物本身和細(xì)菌的小α-淀粉酶不起作用。

α-AI作用的最適pH值為5.6，因此對鞘翅目昆蟲（消化道呈酸性的）有良好抗性。

第70頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四α-AI的三種類型（小麥和大麥）：

單體，12kD。對黃粉蟲、米象的抑制效果明顯優(yōu)于二聚體。二聚體，24kD。對馬鈴薯甲蟲、鋸谷盜的抑制效果優(yōu)于單體。四聚體，60kD。

第71頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四2.抗蟲原理

抑制昆蟲消道內(nèi)α-淀粉酶的活性。α-AI和淀粉酶結(jié)合成的EI復(fù)合物刺激昆蟲過量分泌消化酶，通過神經(jīng)系統(tǒng)反饋，產(chǎn)生厭食反應(yīng)，最后導(dǎo)致非正常發(fā)育或死亡。第72頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四3.淀粉酶抑制劑基因的應(yīng)用Altabella等（1990）把菜豆αAI基因?qū)霟煵荩⒛軠?zhǔn)確、穩(wěn)定地表達(dá)。分析表明：它對黃粉蟲的腸道α-淀粉酶具有顯著的抑制效果，同時(shí)也抑制豬胰α-淀粉酶的活性。對哺乳動(dòng)物的淀粉酶抑制作用大大限制了其在生食作物基因工程中的應(yīng)用。第73頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四第三節(jié)抗植物病毒基因及其應(yīng)用第74頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四病毒病引起的作物病害是十分嚴(yán)重的，僅以馬鈴薯為例，Χ病毒(PVX)引起的產(chǎn)量損失可10%,Y病毒（PVY）引起的損失可達(dá)80％，然而迄今雜交常規(guī)育種對病毒病的防治尚無良策。基因工程技術(shù)為培育抗病毒病的新品種開辟了途徑。植物抗病毒基因工程的技術(shù)路線已趨向成熟。第75頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四基因工程抗病毒的技術(shù)路線：（1）導(dǎo)入病毒外殼蛋白基因。（2）利用病毒的衛(wèi)星RNA（satelliteRNA,Sat-RNA）。（3）利用病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因（特別是復(fù)制酶-replicase基因）。（4）缺損干擾顆粒（人工構(gòu)建）（defectiveinterferingparticle）（5）干擾素（interferon）基因（6）利用反義RNA技術(shù)（7）利用中和抗體法技術(shù)（8）設(shè)計(jì)核酶剪切病毒RNA第76頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四第三節(jié)抗植物病毒基因及其應(yīng)用

一、外源病毒外殼蛋白（coatprotein，CＰ）基因二、病毒復(fù)制酶基因三、衛(wèi)星RNA四、核糖體失活蛋白基因五、干擾素基因六、缺陷干擾穎粒第77頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四一、外源病毒外殼蛋白（CＰ）基因CP基因的抗病毒原理2.轉(zhuǎn)基因植株的特點(diǎn)3．CP基因的應(yīng)用4.存在的問題

第78頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1.CP基因的抗病毒原理當(dāng)入侵病毒的裸露核酸進(jìn)入植物細(xì)胞后，立即被細(xì)胞中的自由CP包裹，阻止了入侵病毒核酸的翻譯和復(fù)制。在ＣＰ水平上抑制病毒脫殼。第79頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四導(dǎo)入的CP基因都是缺失的不完整的，該類基因主要是缺少AUG密碼子，當(dāng)這種不能被翻譯的CP基因或CP基因的反義RNA基因整合到植物染色體上后，能使轉(zhuǎn)基因植株獲得很好的抗性說明這類轉(zhuǎn)基因植株的抗性機(jī)理不是外殼蛋白在起作用，而可能是它們的RNA轉(zhuǎn)錄體與入侵病毒RNA之間相互作用。。第80頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四許多種類病毒組及病毒的ＣＰ基因具有同源結(jié)構(gòu)，在一定的條件下，一種ＣＰ基因?qū)⒖赡芸苟喾N病毒。第81頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四2.轉(zhuǎn)基因植株的特點(diǎn)抗性與ＣＰ表達(dá)量成正相關(guān)。在一定程度上延緩或減輕發(fā)病，不影響生長發(fā)育、孕性表現(xiàn)和生理表現(xiàn)?？剐钥煞€(wěn)定地遺傳給子代。抗性水平與整合到植物細(xì)胞中的CP基因拷貝數(shù)有關(guān)，多拷貝的比單拷貝的抗性高。第82頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四3．CP基因的應(yīng)用

目前已被克隆的CP基因：

TMV、馬鈴薯Ｘ病毒（potatovirusX，PVX）、黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus,CMV)、PVY、水稻條紋葉枯病毒（ricestripevirusvirus,RSV）、TSWV、PLRV、TRV、苜?；ㄈ~病毒（alfafamosaicvirus,ALMV）、洋李痘病毒（plumpoxvirus,PRV）等。第83頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四Monsanto公司在1988年獲得了表達(dá)TMV的CP基因的番茄品種VF36的轉(zhuǎn)基因植株。在接種后表現(xiàn)出延遲發(fā)病，發(fā)病率小于5%，產(chǎn)量幾乎不受影響，而對照植株則100%發(fā)病，果實(shí)減產(chǎn)26-35%。第84頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四Monsanto公司1990年把PVX和PVY的CP基因同時(shí)導(dǎo)入北美最重要的馬鈴薯品種ＲussetBurbank，其中篩選出的一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在接種條件下，完全抗PVX和PVY，而田間試驗(yàn)表明,傳毒蚜蟲接種16周后,轉(zhuǎn)基因植株只有8%的發(fā)病率,而對照植株的發(fā)病率卻高達(dá)79.3%。第85頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四荷蘭Wageningen農(nóng)業(yè)大學(xué)把TSWV的CP基因?qū)霟煵軸R1,試驗(yàn)室接種實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)化植株獲得了90%的保護(hù)效果,而對照株在接種后6天全部發(fā)病。第86頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1991年日本國家農(nóng)業(yè)環(huán)境所獲得了水稻品種KinuhikariNipponbai的轉(zhuǎn)RSV的CP基因的抗紋葉枯病病毒的工程植株，接蟲實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株在2-3周后,只有3%-5%的發(fā)病率,而對照植株的發(fā)病率為95%-100%。這是禾本科作物中用基因工程獲得抗病毒特性的第一例成功報(bào)道。第87頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四奧地利的農(nóng)林大學(xué)的科研人員把歐洲和整個(gè)地中海地區(qū)的核果實(shí)樹的最重要的病毒PVR的ＣＰ基因?qū)胄印５?8頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四在國內(nèi)，中科院微生物所等單位獲得了煙草NC89的雙抗株系（抗MTV＋CMV）和單抗株系（抗TMV）。純合系的大田試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株的抗病毒效果達(dá)70％。已獲得轉(zhuǎn)CP基因植株：煙草、馬鈴薯、水稻、番茄、歐洲李和杏等。第89頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四4.存在的問題

轉(zhuǎn)基因植株對病毒的抗性水平不高，且僅限于特定的病毒或密切相關(guān)的病毒。轉(zhuǎn)基因植株大多只是推遲發(fā)病，而不能徹底根治。第90頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四二、病毒復(fù)制酶基因抗病毒原理應(yīng)用特點(diǎn)

第91頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四病毒復(fù)制酶基因：是病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因。復(fù)制酶一般是在病毒核酸進(jìn)入寄主細(xì)胞并結(jié)合到寄主核糖體之后形成。第92頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1.抗病毒機(jī)理RNA轉(zhuǎn)錄體干擾病毒的復(fù)制。病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因介導(dǎo)抗性。復(fù)制酶基因抑制病毒復(fù)制必須具備2個(gè)條件，1.具有一定空間構(gòu)象。2.不完整性。第93頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四攜有編碼54kD蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草中檢測不到54kD的蛋白產(chǎn)物，這說明很可能是其RNA轉(zhuǎn)錄體干擾了病毒的復(fù)制TMV的編碼126kD的完整基因?qū)胫仓旰螅仓陞s未獲得抗性；而若插入1.4kD的核酸序列，使其基因失去功能，則能賦予植物抗性。。第94頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四把ＴＭＶ的ＲＮA編碼126kD蛋白的通讀部分(readthrough)的54kD（包含病毒復(fù)制酶核心功能團(tuán)）的基因?qū)霟煵?，轉(zhuǎn)基因煙草對TMV表現(xiàn)出很高的抗性(接毒500μg/ml,植株不發(fā)病)。很可能是不完整的復(fù)制酶亞基基因賦予了植物細(xì)胞這種抗性。第95頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四2.病毒復(fù)制酶基因特點(diǎn)

病毒復(fù)制酶基因所介導(dǎo)的抗性強(qiáng)。遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于ＣＰ基因介導(dǎo)的抗性。即使對轉(zhuǎn)基因植株使用高濃度的病毒或其RNA，仍具有明顯抗性。第96頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四3.病毒復(fù)制酶基因的應(yīng)用用豌豆早褐病毒（PEBV）221kD的復(fù)制酶中相當(dāng)于TMV的54kD部分的核酸片段轉(zhuǎn)化煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因植株對高達(dá)1000μg/ml的接種量仍具有高度抗性。第97頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四將編碼CMV復(fù)制酶的二個(gè)亞基的缺失的cDNA轉(zhuǎn)入煙草，工程植株可抗500μg/ml的病毒或100μg/mlRNA的接種量。第98頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四三、衛(wèi)星RNA抗病毒原理應(yīng)用存在問題

第99頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四衛(wèi)星RNA：衛(wèi)星RNA是多核苷酸，它們有時(shí)在其相伴病毒中被發(fā)現(xiàn)。它們按照相伴病毒的復(fù)制和傳播機(jī)制，從一個(gè)植株傳到別一個(gè)植株。它們不與其相伴病毒的核苷酸序列同源，對病毒的復(fù)制也不起作用。但是衛(wèi)星RNA具有改變其相伴病毒的致病力的能力。

第100頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四1.抗病毒原理相應(yīng)病毒侵入植物細(xì)胞，其衛(wèi)星RNA被激活和放大，對病毒產(chǎn)生抗性?？剐运讲灰虿《镜慕臃N量而降低。植物細(xì)胞中只要有低濃度的衛(wèi)星RNA的轉(zhuǎn)錄體即可產(chǎn)生抗性。第101頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四2.病毒衛(wèi)星RNA的應(yīng)用

目前獲得一些帶有病毒衛(wèi)星RNA的轉(zhuǎn)基因植株。如，表達(dá)CMV和煙草環(huán)斑病毒（TRV）的衛(wèi)星序列的轉(zhuǎn)基因煙草植株。當(dāng)被其相應(yīng)的病毒侵染時(shí)，其發(fā)病癥狀減輕。第102頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四3.存在問題

只有少數(shù)植物病毒含有衛(wèi)星RNA，限制了應(yīng)用范圍。衛(wèi)星RNA有可能被其自然的病毒載體包裝并釋放到環(huán)境中。一個(gè)核甘酸的突變可能會(huì)造成嚴(yán)重病狀，或病毒衛(wèi)星RNA和植物衛(wèi)星RNA重組，從而產(chǎn)生一種難以預(yù)料的病癥。有些衛(wèi)星RNA能夠增強(qiáng)病毒的致病力。第103頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四四、核糖體失活蛋白基因1.RIP分類2.RIP作用機(jī)理3.RIP基因的應(yīng)用第104頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四

是一類能抑制蛋白質(zhì)生物合成的蛋白，廣泛存在于高等植物中，含量豐富。核糖體失活蛋白：

（ribosome-inactivatingprotein，RIP）第105頁，共116頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)53分，星期四１.RIP分類

據(jù)結(jié)構(gòu)可為2種類型：I型RIP：是單鏈堿性蛋白質(zhì)。分子量約為30kD，帶有或不帶有糖基，但其生物活性都一樣，都具有抑制無細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的作用,對完整細(xì)胞或動(dòng)物呈無毒或